陳皮黑茶顆粒提取工藝條件對降糖降脂活性成分的影響

劉沁如，向 茗，瞿昊宇，陳光宇，謝夢洲*

(1.湖南中醫(yī)藥大學 中醫(yī)學院，湖南 長沙 410208；2.湖南省藥食同源功能性食品工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410208；3.中醫(yī)心肺病證辨證與藥膳食療重點研究室，湖南 長沙 410208；4.湖南中醫(yī)藥大學 信息科學與工程學院，湖南 長沙 410208)

糖尿病是一種以糖代謝異常為特征的代謝性疾病，其中最常見的類型是2型糖尿病，約占全部糖尿病患者的90%[1]。胰島素抵抗是2型糖尿病的主要特征之一，其主因是脂肪代謝異常；而血脂異常又是糖尿病的常見并發(fā)癥之一。全國營養(yǎng)狀況調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者中20%～90%患有高脂血癥[2]。因此，防治2型糖尿病合并脂代謝異常具有重要意義。目前臨床上使用的降糖藥物中除二甲雙胍和阿卡波糖片在糖尿病前期人群中長期應(yīng)用的安全性較為可靠外，其他藥物長期應(yīng)用時的安全性尚未有充足的證據(jù)支持[3]。調(diào)節(jié)血脂的藥物如他汀類、貝特類等，雖療效顯著，但有肝損傷、橫紋肌溶解等不良反應(yīng)[4]。據(jù)報道[5]，中醫(yī)藥調(diào)理和治療2型糖尿病合并高脂血癥不僅治療效果好，且安全系數(shù)高，值得推廣。除常規(guī)藥物治療外，功能食品對于輔助降糖降脂有特殊優(yōu)勢。本研究的研究對象新會陳皮黑茶茶包是市場上已出售的普通食品，主要原料為陳皮、黑茶，已有相關(guān)文獻[6-7]發(fā)現(xiàn)其有輔助降糖降脂作用，故該茶包可開發(fā)為輔助降糖降脂的保健食品?，F(xiàn)已知陳皮、黑茶中降糖降脂的主要活性成分分別為橙皮苷、川陳皮素、橘皮素及茶多糖[8-10]，因該茶包的使用方法為取一包(10 g)加300～500 mL的沸水浸泡5 min后即可飲用，此劑型及服用方法不能將所有的有效活性成分析出，故本研究將其改成顆粒劑。此外，通過查閱文獻發(fā)現(xiàn)，上述降糖降脂活性成分的提取工藝條件差異較大，無法照搬套用，故為了最大限度地提取陳皮、黑茶降糖降脂的功能成分，本研究探討陳皮、黑茶的提取工藝條件對降糖降脂活性成分的影響，確定最優(yōu)提取工藝參數(shù)，為陳皮黑茶顆粒的工業(yè)化生產(chǎn)及降糖降脂作用的藥效學實驗提供依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

新會陳皮飲片、安化黑茶(均購自廣東金威寶健康產(chǎn)業(yè)有限公司，批號：C0120191224a)；橙皮苷對照品(HPLC≥98%)(上海源葉生物科技有限公司，批號：P06D9F77001)；川陳皮素對照品(HPLC≥98%)(上海源葉生物科技有限公司，批號：N10J10R90249)；橘皮素對照品(HPLC≥98%)(上海源葉生物科技有限公司，批號：H09M7K14409)；無水葡萄糖(HPLC≥98%)(上海沃凱生物技術(shù)有限公司，批號：20161219)；液相色譜柱(月旭科技上海股份有限公司，填充劑：十八烷基硅烷鍵合硅膠UltimateXB-C18，5 μm，4.6 mm×250 mm)；試劑為分析純；實驗用水為純化水或超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平(東京島津儀器有限公司，型號：ATX124型124 g-0.000 1 g)；電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器，型號：DIKW-S-6)；10L旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(日本東京理化，型號：N-3010)；超聲波清洗器(昆山美美超聲儀器，型號：KM5200DE)；冷凍干燥機(寧波新芝生物科技股份有限公司，型號：SCIENTZ-10N)；調(diào)速多用振蕩器(常州榮華儀器制造有限公司，型號：HY-4)；高速冷凍離心機(長沙英泰儀器有限公司，型號：TGL18W)；ltimate3000高效液相色譜系統(tǒng)(賽默飛世爾科技(中國)有限公司，包括G1316A四元梯度泵，G1313A標準型自動進樣器，G1316A恒溫箱，G1314A紫外檢測器，AgilentChemstation色譜工作站)；紫外-可見分光光度計(北京萊伯泰科，型號：UV900B)；水分測定儀(深圳市冠亞水分儀科技，型號：SFY-20BL)。

2 實驗方法

2.1 橙皮苷、川陳皮素及橘皮素的HPLC測量方法[11]

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性實驗 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動相A，以水為流動相B，按表1中的規(guī)定進行梯度洗脫；橙皮苷測量波長為283 nm，川陳皮素和橘皮素檢測波長為330 nm。

表1 流動相比例及流速

2.1.2 對照品溶液的制備 (1)橙皮苷對照品溶液的制備：取橙皮苷對照品10 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，即得1.0 mg/mL橙皮苷對照品溶液，再取橙皮苷對照品濃溶液1.0 mL，置5 mL容量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，即得每1 mL含橙皮苷0.2 mg的橙皮苷對照品溶液。

(2)川陳皮素對照品溶液的制備：取川陳皮素對照品10 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，即得1.0 mg/mL川陳皮素對照品濃溶液，再取川陳皮素對照品濃溶液1.0 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，即得0.1 mg/mL川陳皮素對照品溶液A；取2.5 mL川陳皮素對照品溶液A，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，即得25 μg/mL川陳皮素對照品溶液B。

(3)橘皮素對照品溶液的制備：取橘皮素對照品10 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，即得1.0 mg/mL橘皮素對照品濃溶液，再取橘皮素對照品濃溶液1.5 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，即得0.15 mg/mL橘皮素對照品溶液A；取1.0 mL橘皮素對照品溶液A，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，即得15 μg/mL橘皮素對照品溶液B。

2.1.3 供試品溶液制備 取新會陳皮9個正交試驗所得干浸膏細粉各0.2 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)60 min，放冷后再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，取上清液8 mL于離心管中，在4 000 r/min的條件下離心10 min，取上清液，過濾，取續(xù)濾液。

2.1.4 測定 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各5 μL，注入液相色譜儀測定峰面積積分值，見圖1-圖6。

圖1 橙皮苷對照品色譜

圖2 川陳皮素對照品色譜

圖3 橘皮素對照品色譜

圖4 陳皮干浸膏供試品色譜

圖5 橙皮苷陰性對照品色譜

圖6 川陳皮素和橘皮素陰性對照品色譜

2.2 陳皮提取工藝條件[12-14]

2.2.1 陳皮提取基本方法 取陳皮飲片適當碎段，加入一定倍數(shù)的溶劑，浸泡一定時間，加熱回流提取一定時間，過濾，濾渣進行第二次提取，加入一定倍數(shù)的溶劑，加熱回流提取一定時間，過濾，合并兩次濾液，將濾液在50 ℃、30 r/min、40 hPa的條件下減壓濃縮至相對密度1.30 g/mL左右，再冷凍干燥成干浸膏粉。

2.2.2 陳皮正交設(shè)計試驗方案及結(jié)果分析 將陳皮飲片適當碎段后均勻分成9份，每份精確稱取50.0 g，按正交設(shè)計試驗因素水平表及L9(3)4安排表進行實驗，見表2及表3，以干浸膏得率、橙皮苷、川陳皮素、橘皮素的百分含量為評價指標，統(tǒng)計分析結(jié)果見表4和表5。

表2 陳皮提取工藝因素水平

表3 陳皮提取工藝正交設(shè)計實驗安排及結(jié)果

表4 橙皮苷、川陳皮素、橘皮素及干浸膏得率的因素間方差分析 (P<0.1)

表5 橙皮苷、川陳皮素、橘皮素不同提取條件各因素的水平間方差分析 (P<0.05)

以橙皮苷百分含量為評價指標：A因素水平間差異有統(tǒng)計學意義，A因素取3水平或2水平，B、C、D因素可任意取值；以川陳皮素百分含量為評價指標：A、B、C三個因素水平間差異均具有統(tǒng)計學意義，A因素取3水平，B因素取1水平，C因素取1水平或2水平，D因素可任意取值；以橘皮素百分含量為評價指標：A、B、C三個因素水平間差異皆有統(tǒng)計學意義，A因素取3水平，B因素取1水平或2水平，C因素取1水平，D因素可任意取值；以干浸膏得率為評價指標：A因素水平間差異有統(tǒng)計學意義，A因素取1水平，B、C、D因素可任意取值。

綜上所述，A因素取3水平、B因素取1水平、C因素取1水平、D因素取任意值，考慮降低成本，D因素取3水平為佳，即第一次回流提取加入藥材量35倍的70%乙醇，浸泡1.0 h，回流提取1.5 h；第二次加入藥材量30倍的70%乙醇，回流提取1.0 h。

2.2.3 陳皮提取工藝的驗證試驗及結(jié)果 對陳皮中橙皮苷、川陳皮素、橘皮素的提取最優(yōu)工藝條件進行驗證：取三批陳皮中藥飲片，每批1.0 kg，適當碎斷，加70%乙醇回流提取2次，第一次回流提取加入藥材量35倍的70%乙醇，浸泡1.0 h，回流提取1.5 h，過濾；第二次加入藥材量30倍的70%乙醇，回流提取1.0 h，過濾，合并兩次濾液，在50 ℃、30 r/min、40 hPa的條件下減壓濃縮相對密度1.30 g/mL左右，再冷凍干燥成干浸膏粉，測得橙皮苷含量為11.25%，RSD=2.768%，川陳皮素含量為2.612%，RSD=2.598%，橘皮素含量為1.278%，RSD=2.869%，干浸膏得率為33.43%，RSD=2.834%，提取工藝驗證結(jié)果皆接近或略高于正交設(shè)計試驗中的最高值，表明此工藝條件可最大限度提取出降糖降脂活性成分，該提取工藝參數(shù)科學、合理、穩(wěn)定、可行，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

2.3 硫酸-苯酚分光光度法測定黑茶中茶多糖的含量

2.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取經(jīng)105 ℃干燥至恒重的無水葡萄糖對照品20.4 mg，置100 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得0.204 mg/mL無水葡萄糖對照品溶液。

2.3.2 標準曲線的繪制 精密量取對照品溶液0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.7 mL、1.0 mL，分別置10 mL具塞刻度試管中，分別加超純水補至2.0 mL，再分別精密加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速精密加入硫酸7 mL，密封，用調(diào)速多用振蕩器混勻，放置10 min，置40 ℃水浴中保溫15 min，取出，迅速冷卻至室溫，在490 nm的波長處測定吸光度，繪制標準曲線，得線性回歸方程y=0.037 8x+0.024 7，線性相關(guān)系數(shù)r=0.999 5，結(jié)果表明葡萄糖濃度在0～20.4 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3 供試品溶液的制備方法[15]取黑茶9個正交設(shè)計試驗所得干浸膏細粉約各0.5 g，加入80%乙醇100 mL先研磨使分散成混懸水溶液，再轉(zhuǎn)移至三角瓶中，加熱回流1.0 h，趁熱過濾，濾渣與濾器用熱80%乙醇30 mL分次洗滌，棄去濾液，濾渣連同濾紙置燒瓶中，加水150 mL，加熱回流1.0 h，趁熱過濾，用少量熱水洗滌濾器，合并濾液與洗液，放冷，各干浸膏粉樣品溶液用純化水定容至250 mL，搖勻。

2.3.4 供試品溶液的測定方法[15-16]精密移取制備的供試品溶液1 mL，置10 mL具塞刻度試管中，加水補至2.0 mL，精密加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速精密加入硫酸5 mL，密封，用調(diào)速多用振蕩器混勻，放置10 min，取出，迅速冷卻至室溫，用超純水定容至10 mL刻度，在490 nm的波長處測定吸光度(在1 h內(nèi)測定完畢)，根據(jù)標準曲線線性回歸方程計算多糖含量。

2.4 黑茶水提工藝條件研究[17-18]

2.4.1 黑茶提取基本方法 將黑茶加入一定倍數(shù)的水，浸泡一定時間，在一定的溫度下加熱回流提取一定時間，過濾，濾渣進行第二次提取，加入一定倍數(shù)的水，在一定的溫度下加熱回流提取一定時間，過濾，合并兩次濾液在50 ℃、30 r/min、40 hPa的條件下減壓濃縮至相對密度1.30 g/mL左右，再冷凍干燥成干浸膏粉。

2.4.2 黑茶正交設(shè)計試驗方案及結(jié)果分析 取9份黑茶，每份50.0g，按正交設(shè)計試驗因素水平表及L9(3)4安排表進行實驗，見表6及表7，以干浸膏得率、茶多糖的百分含量為評價指標，統(tǒng)計分析結(jié)果見表8和表9。

表6 黑茶水提工藝因素水平

表7 黑茶水提工藝正交設(shè)計實驗安排及結(jié)果

表8 茶多糖及干浸膏得率的因素間方差分析 (P<0.05)

表9 茶多糖不同提取條件各因素的水平間方差分析 (P<0.05)

以茶多糖百分含量為評價指標：A、B、C三個因素水平間差異皆具有統(tǒng)計學意義，A因素取3水平或2水平、B因素取3水平、C因素取2水平、D因素可任意取值；以干浸膏得率為評價指標：B因素水平間差別具有統(tǒng)計意義，B因素取的3水平，A、C、D因素可任意取值。

綜上所述，A因素取3水平或2水平、B因素取3水平、C因素取2水平、D因素可取任意值，考慮降低成本，A因素取3水平、D因素取3水平為佳，即第一次回流提取加入藥材量25倍的水，浸泡1.5 h，回流加熱1.0 h；第二次加入藥材量25倍的水，回流加熱0.5 h，水提溫度均為100 ℃。

2.4.3 黑茶水提工藝的驗證試驗及結(jié)果 對黑茶水提最優(yōu)工藝條件進行驗證：取三批黑茶顆粒，每批1.0 kg，加水提取2次，水提溫度均為100 ℃；第一次提取加入藥材量25倍的水，浸泡1.5 h，回流加熱1.0 h，過濾；第二次加入藥材量25倍的水，回流加熱0.5 h，過濾，合并兩次濾液，在50 ℃、30 r/min，40 hPa的條件下減壓濃縮至1.30 g/mL左右，再冷凍干燥成干浸膏粉，測得茶多糖含量為17.13%，RSD=2.756%，干浸膏得率為30.62%，RSD=2.819%，提取工藝驗證結(jié)果皆接近或略高于正交試驗中的最高值，表明此工藝條件可最大限度提取出降糖降脂活性成分，該提取工藝參數(shù)科學、合理、穩(wěn)定、可行，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

3 討論

陳皮、黑茶中所含的降糖降脂活性成分主要來自陳皮中的橙皮苷、川陳皮素、橘皮素等黃酮類化合物，黑茶中的茶多糖等，故本研究以橙皮苷、川陳皮素、橘皮素及茶多糖為評價指標研究提取工藝條件對降糖降脂活性成分的影響，為中試生產(chǎn)及降糖降脂作用的藥效學實驗提供理論依據(jù)和最優(yōu)原料，避免因提取工藝條件不當制備的樣品影響降糖降脂功能試驗結(jié)果。

本實驗結(jié)果表明，降糖降脂活性成分橙皮苷、川陳皮素、橘皮素在設(shè)計范圍內(nèi)隨著乙醇濃度的增大而提取量增多，說明這類活性成分醇溶性好，陳皮采用70%乙醇提取可減少雜質(zhì)的浸出，避免微生物污染，還可以增加產(chǎn)品的穩(wěn)定性，縮小食用量，提高適用人群長期服用的順應(yīng)性。

根據(jù)查閱的相關(guān)文獻，陳皮和黑茶的提取次數(shù)均為2次[13，17]，故本研究無須考察提取次數(shù)，采用2次即可；陳皮質(zhì)地較軟，易于掰碎，黑茶質(zhì)地蓬松且體積較小，故本研究不考察粉碎度。