單核苷酸多態(tài)性微陣列芯片技術(shù)用于中晚期妊娠足內(nèi)翻胎兒的遺傳學(xué)分析

李 萌 李 嬌 付華鈺 許涓涓 李 喬 林莉莉 耿國興 歐陽魯平

廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院 (南寧， 530001)

先天性內(nèi)翻足是小兒最常見的下肢先天性畸形，是由復(fù)雜的肌肉、骨骼、神經(jīng)系統(tǒng)病變等而引起的。產(chǎn)前檢查是篩查先天性馬蹄內(nèi)翻足的重要手段，二維超聲、三維超聲、MRI均為有效的診斷方法。盡管國內(nèi)外學(xué)者對先天性足內(nèi)翻的病因進(jìn)行了大量的流行病學(xué)和遺傳學(xué)研究，但是其具體機(jī)制仍然不能明確，遺傳和環(huán)境的聯(lián)合作用是本病比較明確的致病因素，基因突變、血管和肌肉異常亦與其發(fā)病有關(guān)[1-2]。染色體微陣列分析技術(shù)可以檢測基因組水平染色體拷貝數(shù)變異(CNV)，還可檢測染色體嵌合體(嵌合比例>20%)、雜合性缺失(LOH)以及單親二倍體(UPD)等，目前已被廣泛應(yīng)用于胎兒結(jié)構(gòu)畸形、原發(fā)性智力低下、生長發(fā)育遲緩、自閉癥、多發(fā)畸形等異常的診斷及腫瘤遺傳學(xué)診斷等領(lǐng)域[3]。本文通過回顧性分析407例足內(nèi)翻的胎兒產(chǎn)前診斷檢測結(jié)果，探討SNP-array芯片技術(shù)檢測在胎兒足內(nèi)翻胎兒產(chǎn)前診斷中的臨床意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2016年1月-2019年12月就診于本院的166例妊娠中晚期胎兒足內(nèi)翻或合并其他產(chǎn)前高危指征的孕婦，孕周≥16+4周，年齡(31.2±3.6)歲(19～43歲)。經(jīng)知情同意行羊水或臍帶血穿刺取樣，并行染色體核型分析及SNP array檢測。所有對象均接受檢測前的遺傳咨詢并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1取樣對妊娠≤25周者在B超腹部探頭引導(dǎo)下行羊膜腔穿刺抽取羊水30ml、妊娠≥25周者經(jīng)腹臍靜脈穿刺取臍血1.5ml進(jìn)行染色體核型培養(yǎng)，以及SNP array檢測分析。

1.2.2染色體核型分析胎兒羊水或臍帶血進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)、制片、G顯帶,顯微鏡下檢查20個(gè)核型,分析5個(gè)核型,若出現(xiàn)嵌合體則檢查50個(gè)或100個(gè)核型。

1.2.3單核苷酸多態(tài)性芯片(SNParray)檢測應(yīng)用美國Illumina 芯片平臺(tái)對樣本進(jìn)行基因組拷貝數(shù)變異分析。實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格遵循Illumina公司提供的操作流程。采用Illumina掃描儀掃描芯片，掃描信號(hào)圖經(jīng)Illumina的Chas軟件分析、計(jì)算。 數(shù)據(jù)分析參照本實(shí)驗(yàn)內(nèi)部數(shù)據(jù)庫及DGV、ClinGen、ClinVar、DECIPHER、UCSC、OMIM等公共在線數(shù)據(jù)庫。

2 結(jié)果

2.1 染色體核型分析

166例中檢出染色體核型異常13例，檢出率7.8%，其中6例18-三體綜合征，2例21-三體綜合征，1例克氏綜合征，1例超雄綜合征，1例涉及18-三體綜合征合并克氏綜合征，1例染色體缺失，1例衍生染色體。

2.2 SNP array檢測

166例中SNP array檢出異常24例，檢出率14.4%。有致病性的18例中13例與核型分析結(jié)果一致；5例染色體核型未見異常而芯片檢出染色體微缺失/微重復(fù)綜合征(表1)；6例為臨床意義不明，見表1。

表1 SNP array 檢出的5例足內(nèi)翻胎兒臨床表現(xiàn)及妊娠結(jié)局

序號(hào)年齡(歲)臨床診斷 SNP array結(jié)果 (變異類型,大小) 臨床意義 妊娠結(jié)局521胎兒右足內(nèi)翻arr Xp21.2(29,860,689 29,968,175)x0;缺失;0.11Mb致病性。該缺失區(qū)域與OMIM已知致病基因IL1RAPL1基因部分重疊,該基因?yàn)閱伪秳┝坎蛔忝舾行曰?該基因突變可導(dǎo)致X連鎖智力障礙21型(#300143 )終止妊娠

3 討論

文獻(xiàn)報(bào)道，20%的足內(nèi)翻與13三體、18三體或三倍體等染色體非整倍體相關(guān)，足內(nèi)翻可能為已知遺傳學(xué)綜合征的常見表現(xiàn)[4]。本研究中2例足內(nèi)翻胎兒均提示合并心血管、骨骼異常，為18三體綜合征的特征性表現(xiàn)。2例胎兒分別合并頸部淋巴管水囊瘤、鼻骨缺失，為21三體綜合征常見表現(xiàn)。2例胎兒染色體均為22q11．21位置發(fā)生缺失(即“DiGeorge綜合征”)，且均合并心血管異常，說明DiGeorge綜合征與心血管異常密切相關(guān)，與謝玉歡等[5]的研究一致。 超聲發(fā)現(xiàn)足內(nèi)翻可能是某些胎兒綜合征的診斷線索，需關(guān)注其他結(jié)構(gòu)是否異常。因此，對足內(nèi)翻胎兒進(jìn)行產(chǎn)前遺傳學(xué)診斷，對指導(dǎo)優(yōu)生優(yōu)育，提高出生人口質(zhì)量，減少出生缺陷具有重要意義。

SNP array檢測除了能夠檢出CNV外，還能夠檢測出 LOH、UPD，以及三倍體(和其他多倍體)以及一定比例的嵌合體[6]。SNP array技術(shù)可以全部檢出染色體核型分析技術(shù)檢出的染色體非整倍體；在正常核型結(jié)果的遺傳咨詢者中，SNP array技術(shù)可以額外檢測出某些致病性基因組不平衡或遺傳突變[7]。近年研究發(fā)現(xiàn)，CNV與足內(nèi)翻密切相關(guān)[8-9]。本文中SNP array技術(shù)對非整倍體和不平衡性染色體質(zhì)量排的檢出效率和傳統(tǒng)核型分析方法相近，并具有更高的分辨率和敏感性，且SNP array還能發(fā)現(xiàn)額外的，有臨床意義的基因組CNV，尤其是對于產(chǎn)前超聲檢查發(fā)現(xiàn)胎兒結(jié)構(gòu)異常者，已被國內(nèi)與國際細(xì)胞遺傳協(xié)會(huì)推薦為首選檢查方法[10-11]。本文研究顯示，胎兒足內(nèi)翻或合并其他產(chǎn)前高危指征時(shí)行產(chǎn)前診斷技術(shù)檢查，染色體核型異常檢出率與芯片檢測異常檢出率上存在較大差異。本研究166例胎兒足內(nèi)翻的胎兒樣本中，SNP array檢出24例異常，檢出率14.4%(24/166)。24例芯片異常中有18例為致病性，其余6例為臨床意義不明。18例致病性芯片異常病例中，13例染色體核型分析可檢出，其中6例18-三體綜合征，2例21-三體綜合征，1例克氏綜合征，1例超雄綜合征，1例涉及18-三體綜合征合并克氏綜合征，1例染色體缺失，1例衍生染色體，剩余5例為染色體核型未見異常而芯片檢出染色體微缺失/微重復(fù)綜合征。

本文SNP array技術(shù)額外檢出的5例致病性微缺失/微重復(fù)病例中，病例1檢測到2號(hào)染色體q37.3區(qū)域存在約2.75Mb片段缺失，為致病性拷貝數(shù)異常。臨床表現(xiàn)包括發(fā)育遲緩、伴或不伴其他重大形態(tài)發(fā)育異常、上唇裂、肌張力低下、面部異常等[12]。病例2檢測到5號(hào)染色體q13.2q13.3區(qū)域存在1.56Mb片段缺失，為致病性拷貝數(shù)變異。涉及15q13.3 微缺失綜合征(OMIM #612001)，關(guān)鍵基因CHRNA7，KLF13等，攜帶此缺失的患者具有神經(jīng)系統(tǒng)方面異常(如癲癇、自閉癥等)的高風(fēng)險(xiǎn)；患者常見的行為異常主要包括注意力分散，多動(dòng)，可伴有輕度至中度智力低下或?qū)W習(xí)困難，或不伴認(rèn)知功能障礙，臨床表型具有高度異質(zhì)性[13-14]。病例3檢測到16號(hào)染色體p13.3區(qū)域存在約0.11Mb純合缺失，為致病性拷貝數(shù)變異。16號(hào)染色體純合缺失區(qū)域與α地中海貧血相關(guān)，包含2個(gè)致病性O(shè)MIM基因：HBA1和HBA2。HBA1及HBA2基因純合缺失可導(dǎo)致Hb Bart's胎兒水腫綜合征[15]，臨床表現(xiàn)可包括重度貧血、黃疽、全身水腫、肝脾腫大等。病例4中檢出17p12約1.5Mb缺失，為致病性拷貝數(shù)變異，此缺失包含已知綜合征HNPP(遺傳性壓力敏感性周圍神經(jīng)病)，關(guān)鍵基因?yàn)镻MP22，此綜合征的臨床表現(xiàn)為在輕微外傷和不同體表壓迫后，表現(xiàn)出的周期性外周神經(jīng)麻痹或感覺缺失, 包括臂叢或腓總神經(jīng), 尺骨神經(jīng)，正中神經(jīng)等[16]。同時(shí)部分患者還表現(xiàn)為踝反射消失，足弓畸形等。病例5中，檢出X染色體p21.2區(qū)域存在約0.1Mb片段缺失，為致病性拷貝數(shù)變異。該缺失區(qū)域與OMIM已知致病基因IL1RAPL1基因部分重疊，該基因?yàn)閱伪秳┝坎蛔忝舾行曰?，該基因突變可?dǎo)致X連鎖智力障礙21型(#300143)，有文獻(xiàn)報(bào)道該基因內(nèi)部缺失患者可表現(xiàn)為全面性發(fā)育遲緩、智力障礙、自閉癥、脊柱側(cè)凸、斜視及一些行為問題[17-19]，為致病性拷貝數(shù)變異。

另外本文檢出率為7.6%(31/407)臨床意義不明的病例。需通過結(jié)合父母的CNV檢測對結(jié)果作出更好的解釋與遺傳咨詢，一般若為遺傳性的，則臨床意義較小，若為新發(fā)的，則意義較大，但仍需考慮不完全外顯和臨床表型差異的影響。對于純合性狀態(tài)(AOH)是否報(bào)告，應(yīng)以AOH區(qū)域內(nèi)是否涉及嚴(yán)重的后果的隱性遺傳病為參考依據(jù)，如果涉及相關(guān)基因，可在報(bào)告中建議行外顯子測序以排除可能的純合致病基因突變。因此，目前胎兒復(fù)雜足內(nèi)翻作為產(chǎn)前診斷的重要指征，常規(guī)染色體核型檢測的同時(shí)，并行染色體微陣列分析可獲得更多的遺傳學(xué)信息，為胎兒足內(nèi)翻的預(yù)后評估及遺傳咨詢指提供更優(yōu)的臨床決策。