番茄紅素提取工藝的研究

◎ 譚敏捷

（清遠(yuǎn)市食品檢驗(yàn)中心，廣東 清遠(yuǎn) 511500）

番茄紅素（C40H56）是一種非常重要的天然類(lèi)胡蘿卜素，與β-胡蘿卜素是同分異構(gòu)體。其最早從番茄中分離制得，故稱番茄紅素。其分子中有11個(gè)共軛雙鍵和2個(gè)非共軛雙鍵，因此穩(wěn)定性很差，容易發(fā)生順?lè)串悩?gòu)和氧化降解。天然存在的番茄紅素全為反式構(gòu)型，人體組織中則大部分為順式構(gòu)型，長(zhǎng)時(shí)間加熱或者紫外線照射可使其異構(gòu)化，產(chǎn)生部分順式構(gòu)型[1]。它在自然界中分布廣泛，主要存在于番茄、胡蘿卜、西瓜、葡萄、芒果、草莓等成熟的紅色水果和蔬菜中。番茄紅素是脂溶性色素，可溶于其他脂類(lèi)和非極性溶劑中，易溶于氯仿、苯、二硫化碳，可溶于乙醚、石油醚、丙酮、乙酸乙酯等，難溶于甲醇、乙醇，不溶于水[2-3]。

番茄紅素的提取及測(cè)定是目前國(guó)內(nèi)外的一個(gè)研究熱點(diǎn)，主要有有機(jī)溶劑提取法、酶反應(yīng)法、色譜分離法和超臨界流體萃取等方法，其中酶試劑較貴，色譜分離法和超臨界流體法設(shè)備昂貴，故常用操作簡(jiǎn)單、可行性強(qiáng)的有機(jī)溶劑提取法，如采用氯仿、丙酮、乙醚、乙酸乙酯等為提取溶劑的提取法，其中乙酸乙酯是常用的工業(yè)溶劑，對(duì)番茄紅素的提取率較高，并且成本低，常壓下沸點(diǎn)低，易于回收，因此本試驗(yàn)選擇乙酸乙酯作為提取溶劑，研究各種因素對(duì)提取效果的影響，從而為番茄紅素的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)[4]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)原材料

新鮮番茄購(gòu)買(mǎi)于百加肉菜市場(chǎng)

1.2 試驗(yàn)試劑

乙酸乙酯（分析純），廣州化學(xué)試劑廠；乙醇（分析純），廣州化學(xué)試劑廠；

氫氧化鈉（分析純），廣州化學(xué)試劑廠；鹽酸（分析純），廉江市愛(ài)廉化學(xué)試劑有限公司。

1.3 主要試驗(yàn)儀器與設(shè)備

723N可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；HH-601超級(jí)恒溫水浴鍋（江蘇金壇市億通電子有限公司）；AUY120分析天平（SHIMADZU）；pHS-3C+酸度計(jì)（成都世紀(jì)方舟科技有限公司）；TH-300A梯度混合器（上海青浦瀘西儀器廠）；家用搗碎機(jī)（金威馬）；LXJ-IIB飛鴿牌離心機(jī)（上海革安亭科學(xué)儀器廠）。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 樣品的制備

將新鮮番茄用清水沖洗干凈后，用小刀切成小塊，放進(jìn)搗碎機(jī)打碎成漿，先離心脫水1次（4 000 r·min-1,20 min），得到紅色的膏狀番茄糊，用95%乙醇預(yù)處理，按番茄糊∶95%乙醇=1∶3處理，每次20 min，處理兩次，然后離心去上清液后，裝入棕色玻璃瓶備用。乙醇處理的目的是脫水，除去一些雜質(zhì)及黃色素等。

1.4.2 番茄紅素最大吸收波長(zhǎng)的確定

用分析天平稱取5.0 g已制備好的番茄泥于50.0 mL離心管，加入25.0 mL乙酸乙酯，調(diào)節(jié)pH=7，在50 ℃水浴恒溫回流1.5 h后，離心取2.000 mL上清液稀釋5倍于10.0 mL比色管，用乙酸乙酯定容，搖勻后迅速用可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定番茄紅素提取液在不同波長(zhǎng)下的吸光值。

1.4.3 番茄紅素提取工藝流程

番茄紅素提取工藝流程為：新鮮番茄前處理→切碎→搗碎機(jī)破碎→離心機(jī)脫水→95%乙醇預(yù)處理（兩次，每次20 min）→離心→稱重→乙酸乙酯水浴恒溫回流→離心→取上清液定容→測(cè)吸光值。

1.4.4 番茄紅素的測(cè)定及分析方法

對(duì)粗提液的測(cè)定采用吸光度法，用移液器從粗提液中取2 mL于10 mL比色管，用乙酸乙酯定容，搖勻后迅速在502 nm波長(zhǎng)下測(cè)定溶液的吸光值（用乙酸乙酯做參比）。不同提取工藝條件下提取相同量番茄糊得到的提取液定容到相同的體積后，在502 nm波長(zhǎng)下測(cè)定提取液的吸光值。吸光度用A表示。A=abc，其中a為吸光系數(shù)，單位L/(g·cm)；b為液層厚度（通常為比色皿的厚度），單位cm；c為溶液濃度，單位g·L-1，番茄紅素的含量c可通過(guò)吸光值得到，因此由吸光值可知番茄紅素含量的高低，本試驗(yàn)番茄紅素的提取率采用吸光值來(lái)表示。

1.4.5 番茄紅素提取的單因素試驗(yàn)

對(duì)番茄紅素提取過(guò)程中的提取溫度、提取時(shí)間、pH、料液比、提取級(jí)數(shù)逐個(gè)進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

（1）pH對(duì)番茄紅素提取率的影響。稱取5份已預(yù)處理的番茄糊5.000 g，分別置于50.0 mL離心管，均加入25.0 mL乙酸乙酯，再用5%的NaOH調(diào)pH值分別為4、5、6、7和8，在50 ℃水浴恒溫回流1.5 h，離心，取上清液2.000 mL稀釋5倍于10.0 mL比色管，用乙酸乙酯定容，搖勻后迅速在502 nm處測(cè)吸光值。每組3個(gè)平行。

（2）提取溫度對(duì)番茄紅素提取率的影響。稱取5份已預(yù)處理的番茄糊5.000 g，分別置于50.0 mL離心管，均加入25.0 mL乙酸乙酯，再用5%的NaOH調(diào)pH值為7，分別在40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃和80 ℃水浴恒溫回流1.5 h，離心，取上清液2.000 mL稀釋5倍于10.0 mL比色管，用乙酸乙酯定容，搖勻后迅速在502 nm處測(cè)吸光值。每組3個(gè)平行。

（3）提取時(shí)間對(duì)番茄紅素提取率的影響。稱取5份已預(yù)處理的番茄糊5.000 g，分別置于50.0 mL離心管，均加入25.0 mL乙酸乙酯，再用5%的NaOH均調(diào)pH值為7，在50 ℃水浴恒溫分別回流0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h和2.5 h，離心，取上清液2.000 mL稀釋5倍于10.0 mL比色管，用乙酸乙酯定容，搖勻后迅速在502 nm處測(cè)吸光值。每組3個(gè)平行。

（4）料液比對(duì)番茄紅素提取率的影響。稱取5份已預(yù)處理的番茄糊5.000 g，分別置于50.0 mL離心管，分別加入按料液比1∶4、1∶5、1∶6、1∶7和1∶8，再用5%的NaOH均調(diào)pH值為7，在50 ℃水浴恒溫分別回流1.5 h，離心，取上清液2.000 mL稀釋5倍于10.0 mL比色管，用乙酸乙酯定容，搖勻后迅速在502 nm處測(cè)吸光值。每組3個(gè)平行。

（5）提取級(jí)數(shù)對(duì)番茄紅素提取率的影響。稱取5份番茄糊5.000 g，分別置于50.0 mL離心管，均加入25.0 mL乙酸乙酯，再用5%的NaOH均調(diào)pH值為7，在50 ℃水浴恒溫分別回流1.5 h離心，取上清液2 mL稀釋5倍于10.0 mL比色管，用乙酸乙酯定容，搖勻后迅速在502 nm處測(cè)吸光值。再用25.0 mL乙酸乙酯對(duì)去上清后的番茄糊提取1.5 h，經(jīng)上述同樣的操作在502 nm下測(cè)吸光值，接著再用25.0 mL乙酸乙酯進(jìn)行第3次提取，1.5 h后去上清定容，測(cè)吸光值，再接著用25.0 mL乙酸乙酯進(jìn)行第4次提取，測(cè)吸光值。每組3個(gè)平行。

1.4.6 番茄紅素提取的正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇浸提時(shí)間、浸提溫度、料液比以及提取級(jí)數(shù)為4個(gè)影響因素，每個(gè)因素3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，用極差分析法確定最佳提取工藝條件。正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄紅素最大吸收波長(zhǎng)的確定

由圖1可知，番茄紅素在波長(zhǎng)440～510 nm處出現(xiàn)3個(gè)吸收峰，分別為444 nm、472 nm、502 nm，這與相關(guān)文獻(xiàn)描述的基本相符。在最大吸收波長(zhǎng)下，用可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定溶液的吸光度，以此來(lái)表示番茄紅素的濃度，用朗伯-比爾定律計(jì)算番茄紅素的含量，此法不需要昂貴的番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品，而且操作簡(jiǎn)便，適宜番茄紅素粗提取階段的濃度測(cè)定[5-6]。由于與番茄紅素共存的其他類(lèi)胡蘿卜素如β-胡蘿卜素，在472 nm處也有1個(gè)較強(qiáng)的吸收峰，這會(huì)對(duì)測(cè)定造成干擾，張連富、丁霄霖等人建立了一種番茄紅素的簡(jiǎn)便測(cè)定方法，即選擇502 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)，避免了其他類(lèi)胡蘿卜素的影響。因此本試驗(yàn)的后續(xù)工作中，均在該波長(zhǎng)下測(cè)定各次試驗(yàn)提取液的吸光度，比較吸光值的大小，根據(jù)朗伯-比爾定律計(jì)算番茄紅素的提取率[7-10]。

圖1 番茄紅素的吸收光譜圖

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 pH對(duì)番茄紅素提取率的影響

由圖2可知，在其他條件相同的情況下，不同pH下番茄紅素的吸光值不同，酸性越大，番茄紅素的穩(wěn)定性越差，當(dāng)pH=7時(shí)番茄紅素提取率最高。pH＞7時(shí)，番茄紅素提取率有所下降。由試驗(yàn)可知，番茄紅素的最佳提取pH為7。

圖2 pH對(duì)番茄紅素提取率的影響圖

2.2.2 提取溫度對(duì)番茄紅素提取率的影響

由圖3可知，在其他條件相同的情況下，番茄紅素吸光度與溫度關(guān)系近似線性關(guān)系，在所選范圍內(nèi)，當(dāng)提取溫度為60 ℃時(shí)，番茄紅素提取率達(dá)到最佳值。這是因?yàn)殡S著溫度的上升，分子運(yùn)動(dòng)速度加快，有利于番茄紅素的滲出。但溫度達(dá)到70 ℃以上，番茄紅素氧化被破壞，提取液變渾濁，從而使番茄紅素提取率下降。同時(shí)考慮到提取劑的沸點(diǎn)及揮發(fā)性，以減少溶劑損失。由試驗(yàn)可知，番茄紅素的最佳提取溫度約為60 ℃，這時(shí)番茄紅素的質(zhì)量達(dá)到最好，過(guò)濾后能得到澄清的溶液。

圖3 提取溫度對(duì)番茄紅素得率的影響圖

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)番茄紅素提取率的影響

由圖4可知，在其他條件相同的條件下，不同的浸提時(shí)間吸光值不同，當(dāng)浸提時(shí)間為1.5 h時(shí)，提取效果最好；提取時(shí)間小于1.5 h，提取率隨提取時(shí)間的增加而增加，而當(dāng)浸提時(shí)間超過(guò)1.5 h，隨著浸提時(shí)間的進(jìn)一步增加，番茄紅素的提取率反而逐漸減小。這可能是超過(guò)一定的時(shí)間后，因?yàn)闇囟鹊绕渌蛩氐挠绊?，番茄紅素被氧化損失，提取率反而下降。因此確定最佳提取時(shí)間為1.5 h。

圖4 提取時(shí)間對(duì)番茄得率的影響圖

2.2.4 料液比對(duì)番茄紅素提取率的影響

由圖5可知，在其他條件相同的情況下，隨著料液比的增大，吸光值增大，番茄紅素的提取率也隨之增大，但在料液比達(dá)到1∶6后，番茄紅素的提取率增長(zhǎng)緩慢，幾乎趨于平緩，原因是溶劑與番茄糊已充分混合。當(dāng)料液比為1∶6提取率最大，考慮到試驗(yàn)的成本及效率，確定最佳料液比為1∶6。

圖5 料液比對(duì)番茄紅素得率的影響圖

2.2.5 提取級(jí)數(shù)對(duì)番茄紅素提取率的影響

用提取劑提取目標(biāo)產(chǎn)物時(shí)，提取次數(shù)越多，目標(biāo)產(chǎn)物總提取量也越多，這是試驗(yàn)提取所需的結(jié)果，但同時(shí)提取劑消耗量也越多，不利于后蒸發(fā)溶劑進(jìn)行濃縮的操作。由圖6可知，當(dāng)提取級(jí)數(shù)達(dá)到3級(jí)時(shí)，番茄紅素提取液的所測(cè)吸光值已小于0.05，這時(shí)番茄紅素已基本提取完全，故應(yīng)選擇提取級(jí)數(shù)為3。

圖6 提取級(jí)數(shù)對(duì)番茄紅素得率的影響圖

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

為了進(jìn)一步確定番茄紅素提取工藝的最優(yōu)條件，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇浸提時(shí)間、浸提溫度、料液比和提取級(jí)數(shù)為影響因素，進(jìn)行4因素3水平的L9（34）正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)結(jié)果，如表2所示。

由表2可知：R值由大到小依次為C＞B＞D＞A因素，即對(duì)番茄紅素提取影響最大的為料液比，然后依次為提取級(jí)數(shù)、提取溫度和提取時(shí)間。根據(jù)kA2＞kA3＞kA1,得A2為最優(yōu)水平；kB3＞kB2＞kB1,得B3為最優(yōu)水平；kC3＞kC2＞kC1,得C3為最優(yōu)水平；kD1＞kD3＞kD2,得D1為最優(yōu)水平。因素主次關(guān)系為C（料液比）＞B（提取級(jí)數(shù)）＞D（提取溫度）＞A（提取時(shí)間），則正交試驗(yàn)得到的最優(yōu)組合為A2B3C3D1，即提取時(shí)間1.5 h，提取級(jí)數(shù)為3，料液比1∶7，提取溫度50 ℃。

表2 番茄紅素提取條件優(yōu)化方案及正交試驗(yàn)結(jié)果表

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

在最佳提取條件下，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到番茄紅素的吸光值為0.906，與正交試驗(yàn)結(jié)果相符。

3 結(jié)論

若采用新鮮番茄，打碎離心脫水后進(jìn)行95%乙醇預(yù)處理兩次，使一些醇溶性的黃色素和一些水溶性雜質(zhì)除去，然后將番茄糊與乙酸乙酯按1∶7的料液比混合，調(diào)節(jié)pH=7，50 ℃水浴恒溫回流1.5 h以提取番茄紅素，提取效果最佳。50 ℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮回收乙酸乙酯，番茄紅素經(jīng)冷卻結(jié)晶，此時(shí)的番茄紅素可進(jìn)行進(jìn)一步純化。乙酸乙酯低毒性，成本較低，易回收，故用此方法提取番茄紅素適合工業(yè)生產(chǎn)，但應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)需進(jìn)一步研究。