基于GC-TOF/MS的卷柏不同生長階段代謝組學(xué)研究

席彩彩，谷 巍,2*，周 晨，張阿琴，王 帆

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023；2.江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023)

卷柏Selaginellatamariscina(Beauv.)spring為蕨類卷柏科卷柏屬植物，在我國各地均有分布，具有破血散瘀、活血止血的功能[1-3]。卷柏是典型極端耐旱的復(fù)蘇維管植物，干旱時植株向內(nèi)卷成一團，顏色枯黃，但它能在相當(dāng)長時間里保持生命，一旦遇水，便會植株伸展返綠，因此民間常稱其為“九死還魂草”[4-5]。對于卷柏的形態(tài)及產(chǎn)地最早記載見于《名醫(yī)別錄》，它喜光，多生于向陽的山坡巖石上或干旱的巖石縫中，在溫度20 ℃左右的潮濕地方生長正常[6-7]。全年均可采收[8]，采收期區(qū)別于古籍記載。

中藥質(zhì)量的優(yōu)劣取決于有效成分的含量，后者會隨生長過程發(fā)生不同程度的動態(tài)變化，因此適時采收是保證中藥材質(zhì)量的先決因素之一[9]。卷柏化學(xué)成分復(fù)雜多樣，目前對其成分的測定方法大多為GC-MS、HPLC、TLC等，僅局限于某幾個特征成分，忽略了其他成分的變化。代謝組學(xué)從植物生物體系的整體性和動態(tài)性出發(fā)，研究植物代謝產(chǎn)物的動態(tài)變化，不僅可以觀察到化學(xué)成分的積累過程，還可以發(fā)現(xiàn)各成分之間的相互轉(zhuǎn)化規(guī)律，可從整體上科學(xué)評價藥材的質(zhì)量[10-12]。

本研究借鑒植物代謝組學(xué)的思路和方法，研究三個不同生長階段卷柏樣品的代謝產(chǎn)物的不同，尋求差異化合物，探究其動態(tài)變化，采用肟化-硅烷化衍生法GC-TOF/MS技術(shù)分析卷柏三個不同生長階段樣品的化學(xué)成分，并通過主成分分析(PCA)和偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA)進行數(shù)據(jù)處理，找出差異顯著的化學(xué)成分及其變化規(guī)律，為卷柏商品藥材質(zhì)量的綜合評價及卷柏藥材的采收提供參考，為卷柏復(fù)蘇機制研究提供依據(jù)，為其綜合開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器 ALEX-CIS GCTOF-MS氣質(zhì)聯(lián)用儀(美國Leco公司)；MIKRO220/220R型離心機(德國Hettich公司)；AX324ZH型電子分析天平(美國Ohaus公司)；移液槍(德國Eppendorf公司)；微型旋渦混合器(德國BOECO公司)。

1.2 試劑與藥物 甲氧胺鹽酸鹽(CH3ONH2·HCl)、飽和脂肪酸甲酯、N-甲基-N-三甲硅基三氟乙酰胺、吡啶均為色譜純購自美國Sigma-Aldrich公司；其余試劑均為分析純；水為蒸餾水。卷柏全草分別于2014年5月、2014年9月、2015年1月采自江蘇省連云港前云臺、中云臺、后云臺山，每個生長期采集3批，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源教研室谷巍教授鑒定為卷柏科植物卷柏Selaginellatamariscina(Beauv.)spring，除去須根洗凈曬干備用，保存于南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，具體信息見表1。

表1 樣品信息

2 方法

2.1 分析條件

2.1.1 色譜 rtx5Sil-MS型毛細管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；載氣高純氦氣(99.999%)；體積流量為1 mL/min；程序升溫(50 ℃保持1 min，以20 ℃/min 升至330 ℃，保持5 min)；進樣口溫度50 ℃，以12 ℃/s升至250 ℃；進樣量0.5 μL；不分流，無溶劑延遲。

2.1.2 質(zhì)譜 電子電離源(EI)；檢測器電壓1 800 V；傳輸線溫度230 ℃；離子源溫度250 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z80～500；電子能量為70 eV。

2.2 供試品溶液制備 取不同生長階段、批次卷柏2 g粉碎，加入10 mL乙腈-異丙醇-水(3∶3∶2,脫氣，-20 ℃)超聲提取2次，每次30 min，渦旋10 s，在4 ℃下振搖5 min，離心，移出上清液，凍干，經(jīng)乙腈-水(3∶1)萃取，離心，取上清液濃縮。采用肟化-硅烷化衍生法，向樣品中加入2 μL C8～C30脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)混合液(溶于氯仿，C8～C160.8 mg/mL，C18～C300.4 mg/mL)，加入40 μL新鮮配制的20 mg/mL甲氧胺吡啶鹽酸溶液，在30 ℃下反應(yīng)90 min，750 r/min快速攪拌，發(fā)生肟化反應(yīng)，最后加入40 μLN-甲基-N-三甲硅基三氟乙酰胺，750 r/min快速攪拌，在37 ℃下反應(yīng)50 min，實現(xiàn)活潑氫的三甲硅烷基化作用[13]，放冷，過0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.3 方法學(xué)考察 精密吸取同一供試品溶液，在“2.1”項條件下進樣測定6次，于0、4、8、12、24 h進樣檢測；按“2.2”項下方法平行衍生化制備6份供試品溶液，在“2.1”項條件下進樣測定，計算各主要色譜峰相對內(nèi)標(biāo)的保留時間和峰高RSD，考察儀器精密度、供試品溶液的穩(wěn)定性、樣品制備重復(fù)性。

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)考察 主要色譜峰相對保留時間和相對峰高RSD均小于2%，表明儀器精密度良好，溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定，方法重復(fù)性理想。

3.2 GC-TOF/MS分析 共檢測出代謝產(chǎn)物441個，鑒定出化合物182個，見表2。

表2 GC-TOF/MS分析結(jié)果

3.3 多元統(tǒng)計分析

3.3.1 主成分分析 采用PCA多變量模式識別方法[14]，對3個生長階段樣品數(shù)據(jù)進行降維分析，其得分圖(t[1]56.5%，t[2]30.8%)見圖1。由此可知，不同生長階段樣品數(shù)據(jù)分布在不同區(qū)域，分類結(jié)果較為理想，表明其成分存在明顯差異；樣品在PCA軸上呈現(xiàn)逐步變化的趨勢，5月采收的分布在PC1軸正方向，9月、1月采收的分布在PC1軸負方向，各自聚為一類，表明5月采收的在代謝組成上與9月、1月采收的有明顯不同。

3.3.2 偏最小二乘法判別分析 對3個生長階段樣品數(shù)據(jù)進行PLS-DA分析[15](5月與9月、5月與1月、9月與1月)，結(jié)果見圖2a、2c、2e，可知每2組樣品數(shù)據(jù)分別沿PC1軸明顯分開，其中模型參數(shù)R2X(cum)分別為0.946、0.901、0.897；R2Y(cum)分別為0.999、0.999、0.998；Q2分別為0.998、0.997、0.995，表明模型有效可靠，與無監(jiān)督的主成分分析(PCA)相比，2個生長期的樣品數(shù)據(jù)得到了更大程度的分離，有助于尋找差異性成分。VIP得分圖見圖2b、2d、2f，可知對2組分類貢獻較大的差異性成分(VIP>1)分別有23、26、25個特征峰。

3.4 差異性成分分析

3.4.1 定性鑒定 將PLS-DA分析結(jié)果得到的3組對分類貢獻較大的差異性成分進行比對，得到15個共有差異性成分，見表3。

表3 樣品中共有差異性成分

注：A為5月，B為9月，C為1月。圖1 不同采收期樣品的PCA得分圖

注：A為5月，B為9月，C為1月。圖2 樣品數(shù)據(jù)的PLS-DA得分圖、VIP得分圖

3.4.2 相對含量 提取各共有差異性成分在各組樣品間對應(yīng)的相對峰高來表示其相對含量，對同一化學(xué)成分在不同生長階段樣品間相對峰高平均值的標(biāo)準(zhǔn)差進行計算，結(jié)果見圖3。由此可知，5月采收的樣品中相對含量最高的化合物有7個，分別為海藻糖、硬脂酸、麥芽糖、甘油、赤蘚糖醇、棕櫚酸、甘露醇；9月采收的樣品中相對含量最高的化合物有6個，分別為天冬氨酸、檸檬酸、谷氨酰胺、鳥氨酸、焦谷氨酸、色氨酸；1月采收的樣品中相對含量最高的化合物有2個，分別為蔗糖和丙氨酸，即5月采收的樣品差異性成分數(shù)量最多。

注：a為海藻糖，b為天冬氨酸，c為檸檬酸，d為谷氨酰胺，e為硬脂酸，f為鳥氨酸，g為麥芽糖，h為甘油，i為赤蘚糖醇，j為焦谷氨酸，k為色氨酸，l為蔗糖，m為棕櫚酸，n為甘露醇，o為丙氨酸。A為5月，B為9月，C為1月。圖3 不同生長階段樣品中差異性成分相對含量

3.4.3 顯著性檢驗及代謝通路分析 5月、9月采收的樣品中，海藻糖、天冬氨酸、檸檬酸、谷氨酰胺、硬脂酸、鳥氨酸、麥芽糖、甘油、赤蘚糖醇、焦谷氨酸、色氨酸、棕櫚酸含量有顯著差異(P<0.01)；5月、1月采收的樣品中，海藻糖、天冬氨酸、檸檬酸、谷氨酰胺、硬脂酸、鳥氨酸、麥芽糖、赤蘚糖醇、焦谷氨酸、色氨酸、棕櫚酸、甘露醇、丙氨酸含量有顯著差異(P<0.01)；9月、1月采收的樣品中，天冬氨酸、檸檬酸、谷氨酰胺、焦谷氨酸、色氨酸、棕櫚酸、丙氨酸含量有顯著差異(P<0.01)；天冬氨酸、檸檬酸、谷氨酰胺、焦谷氨酸、色氨酸、棕櫚酸含量在不同生長階段樣品中均有顯著差異(P<0.01)。

采用MetaboAnalyst 4.0 數(shù)據(jù)庫對天冬氨酸、檸檬酸、谷氨酰胺、焦谷氨酸、色氨酸、棕櫚酸進行代謝通路分析，結(jié)果見圖4(圖中每個圓圈代表一條代謝通路，圓圈顏色表示P值大小，顏色越紅其P值越小，顯著性越高，其對應(yīng)的-logP值越大；圓圈的大小則表示該代謝通路的影響力大小，圓圈越大，說明它的影響力越大)，將代謝途徑的影響得分大于0.05、P值小于0.05設(shè)為權(quán)重影響篩選標(biāo)準(zhǔn)[16-17]。由此可知，丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代謝，二羧酸代謝，檸檬酸循環(huán)(TCA循環(huán))，色氨酸代謝受影響較大，以丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代謝更明顯。

注：A為氨酰-tRNA生物合成，B為丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，C為甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，D為精氨酸和脯氨酸代謝，E為吲哚生物堿的生物合成，F(xiàn)為賴氨酸生物合成，G為二羧酸代謝，H為檸檬酸循環(huán)，I為色氨酸代謝。圖4 代謝通路代謝得分總圖

4 討論

卷柏代謝物繁雜，包含黃酮、炔酚酮、酚酸類等較強極性非揮發(fā)性代謝物，本實驗選用肟化-硅烷化衍生法將卷柏代謝物中非揮發(fā)性成分經(jīng)過衍生化后成為具有揮發(fā)性的成分，克服了傳統(tǒng)GC-MS只能測定揮發(fā)性成分的缺陷。選用GC-TOF/MS分析，為全掃描質(zhì)譜，每一個采集到的數(shù)據(jù)點都有一張完整的質(zhì)譜與之對應(yīng)。與四級桿質(zhì)譜相比，飛行時間質(zhì)譜可以檢測到更多揮發(fā)性化合物，靈敏度高，因此用該方法?？梢詸z測到特殊的或不常見的代謝物。同時選用峰高代替峰面積，峰高對于檢測低含量的及極性相近的代謝產(chǎn)物更加靈敏，同時克服了受基線影響的困難[10-12,18-21]。結(jié)果檢測出卷柏代謝產(chǎn)物441個，并鑒定出182個，大大提高了檢測效率，使檢測出的卷柏代謝物數(shù)量明顯增加。

通過PLS-DA分析篩選出三個生長期卷柏樣品間的15個共有差異性成分，其中5月的海藻糖、硬脂酸、麥芽糖、甘油、赤蘚糖醇、棕櫚酸、甘露醇的含量相對較高，5月為卷柏生命開始復(fù)蘇的季節(jié)，體內(nèi)海藻糖含量達到最高，海藻糖含量變化與卷柏復(fù)蘇密切相關(guān)，亦與課題組前期研究結(jié)果一致[22]。PCA分析結(jié)果顯示5月卷柏在代謝組成上和9月、1月采集的樣品有明顯不同，5月所含含量高的差異化合物個數(shù)最多，與代謝活躍有關(guān)，研究表明5月份左右有利于藥效成分穗花杉雙黃酮(藥典含量測定成分)的積累[8,23]，與古籍記載中的“五、七月采”相符。9月的天冬氨酸、檸檬酸、谷氨酰胺、鳥氨酸、焦谷氨酸、色氨酸含量相對較高，9月天氣逐漸轉(zhuǎn)涼，卷柏體內(nèi)開始失水，機體調(diào)動體內(nèi)氨基酸來抵抗外界脅迫維持機體生命。1月的蔗糖和丙氨酸的含量相對較高，可能與卷柏失水處于休眠狀態(tài)有關(guān)。此結(jié)果表明卷柏一年中代謝產(chǎn)物的動態(tài)變化過程，說明卷柏一年中參與代謝過程的成分因時間的變化而變化。經(jīng)過SPSS分析得出天冬氨酸、檸檬酸、谷氨酰胺、焦谷氨酸、色氨酸和棕櫚酸在三個不同生長階段樣品中均表現(xiàn)顯著差異，說明這6個化合物含量最易受到生長期的影響，并結(jié)合代謝通路分析，得出丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝受影響最大，糖分解代謝的中間產(chǎn)物可以轉(zhuǎn)變成組成蛋白質(zhì)的許多非必需氨基酸，從而參與氨基酸代謝途徑，與課題組前期研究一致。推測丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸在卷柏復(fù)蘇與代謝調(diào)控中發(fā)揮重要作用。研究結(jié)果為卷柏藥材質(zhì)量評價、采收及復(fù)蘇機制研究提供科學(xué)依據(jù)。