安神定志方對慢性疲勞綜合征大鼠色氨酸代謝通路及運動能力的影響

韓 玲，顏志浪，劉長征

(1.宜春學院美容醫(yī)學院，江西 宜春 336000；2.南昌醫(yī)學院，江西 南昌 330004)

慢性疲勞綜合征(chronic fatigue syndrome，CFS)是一種持續(xù)時間大于6個月的體力、腦力疲勞綜合征，近年來隨著工作、生活壓力增大，發(fā)病率逐步上升，其主要臨床癥狀為極度疲勞、食欲不振、肌肉關節(jié)痛、發(fā)熱頭痛等，還同時伴有失眠、抑郁及情緒低落等心理精神癥狀，對患者的工作和生活造成嚴重影響[1-2]。氧自由基引發(fā)的炎癥及氧化應激反應與慢性疲勞綜合征的發(fā)生密切相關，炎癥和脂質(zhì)過氧化可使細胞內(nèi)酶變性失活，損傷線粒體等細胞器，促使細胞衰老、凋亡，造成機體組織器官功能低下，產(chǎn)生疲勞感[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，慢性疲勞綜合征的發(fā)生還與色氨酸代謝異常引起的5-HT系統(tǒng)功能紊亂有關，5-HT是一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，可提高大腦對疲勞信號的敏感性，高水平5-HT可影響睡眠，使機體產(chǎn)生疲倦感，5-HT是色氨酸的代謝產(chǎn)物，因而色氨酸代謝水平可影響慢性疲勞綜合征的發(fā)生發(fā)展[5]。安神定志方由遠志、石菖蒲、茯神、茯苓、龍齒、黨參組成，具有健脾益氣、鎮(zhèn)驚安神、健脾寧心的功效，可降低炎癥因子水平，抑制炎癥反應，減輕阿爾茨海默病大鼠神經(jīng)元損傷，修復大腦學習、記憶功能，還對抑郁癥、焦慮癥、原發(fā)性失眠具有較好的療效[6-9]，因而推測安神定志方可能對慢性疲勞綜合征具有一定的療效，本文通過建立CFS模型大鼠，探討其對CFS大鼠色氨酸代謝通路及運動能力的影響。

1 材料

1.1 動物 清潔級雄性SD大鼠，體質(zhì)量200～240 g，購自廣東中醫(yī)藥大學動物實驗中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(粵)2013-0034，在宜春學院美容醫(yī)學院動物房中飼養(yǎng)，維持室內(nèi)溫度25 ℃，相對濕度50%，整體環(huán)境清潔安靜，通風良好，自然光照，定期更換墊料，保證飼料、飲水充足。

1.2 藥物、試劑及儀器 安神定志方由遠志5 g、石菖蒲5 g、茯神15 g、茯苓15 g、龍齒25 g、黨參15 g組成[北京同仁堂(集團)有限公司]；蓯蓉益腎顆粒(2 g/袋，內(nèi)蒙古蘭太藥業(yè)有限責任公司，國藥準字Z20030099)。大鼠色氨酸ELISA試劑盒(廈門侖昌碩生物科技有限公司，貨號LCS34609)；SOD檢測試劑盒、MDA檢測試劑盒及大鼠IL-6、5-HT、TNF-α ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號A001-3-2、A003-1-2、H007、H104、H052)。SA215曠場實驗系統(tǒng)、SA210懸尾實驗系統(tǒng)(江蘇賽昂斯生物科技有限公司)；XR-XC105型Morris水迷宮系統(tǒng)(安徽正華生物儀器設備有限公司)；XPN-100低溫高速離心機[貝克曼庫爾特生物科技(蘇州)有限公司]。

2 方法

2.1 建模、分組與給藥 采取慢性束縛和冷水力竭游泳相結合的方法制備模型[10]，將大鼠放入一個長18 cm、直徑7 cm、前端有內(nèi)徑為1.5 cm的漏斗樣通氣口的圓柱形塑料筒中，進行束縛來限制其活動，每天30 min，然后放入內(nèi)壁光滑的游泳箱內(nèi)游泳至力竭，以頭部沉入水中3 s不能回到水面或游泳動為無力失調(diào)，水深約45 cm，水溫18～22 ℃，每天1次，持續(xù)2周，當大鼠體質(zhì)量明顯減輕、毛發(fā)稀疏泛黃、背部皮膚松弛、大便干結或稀溏，表現(xiàn)出精神萎靡、四肢蜷臥、飲食減少等疲勞癥狀時，可認為模型構建成功，共建模63只，取其中成功得60只隨機分為模型組，安神定志方低、中、高劑量組(50、100、200 mg/kg)，蓯蓉益腎顆粒(417 mg/kg)組，每組12只，另取12只SD大鼠作為對照組。

將1劑安神定志方[7](生藥80 g)加800 mL水浸泡12 h，煎煮后過濾3次，合并濾液，濃縮至1 000 mL，生藥量為80 mg/mL，生理鹽水稀釋至5、10、20 mg/mL；蓯蓉益腎顆粒[11]以生理鹽水溶解，得到41.7 mg/mL藥液，灌胃劑量均為10 mL/kg，模型組、對照組灌胃給予等劑量生理鹽水，每天1次，持續(xù)21 d。

2.2 大鼠運動能力檢測

2.2.1 鼠尾懸掛實驗 尼龍繩一端捆綁在大鼠尾端1 cm處，另一端固定在橫桿上，使其頭朝下呈倒掛狀態(tài)，頭部距地面1 m左右時會掙扎，一段時間后因體力和心理變化，會間隔性地出現(xiàn)靜止不動狀態(tài)，記錄5 min內(nèi)靜止不動時間[12]。

2.2.2 冷水竭力游泳實驗 按“2.1”項下方法，測定大鼠游泳至力竭所用時間。

2.2.3 曠場實驗 將大鼠置于空地上自由活動，空地有20個大小一致的方格，觀察并記錄大鼠在3 min內(nèi)穿越方格的格數(shù)(以三爪及三爪以上均進入同一方格為準)[13]。

2.2.4 Morris水迷宮實驗 將水池(直徑160 cm、高50 cm)平分為4個象限，于正中固定4個不同標記，作為第一、二、三、四象限參照，向水池加水，使水深為22 cm，水溫約25 ℃，在第三象限正中放置1個平臺，直徑12 cm、高20 cm，大鼠在水池中做適應訓練5 d，第6天開始實驗，將大鼠依次從第一至第四象限面朝池壁的標記放入水中，記錄找到水下平臺的時間，即為平均逃避潛伏期；撤去平臺，重復實驗，記錄大鼠在1 min內(nèi)穿越平臺原位置的次數(shù)[14]。

2.3 標本收集 運動行為學實驗結束后，各組大鼠尾靜脈取血5 mL，靜置15 min后4 ℃、3 000 r/min離心15 min，取上清，血清在-80 ℃下保存?zhèn)溆谩Ｒ颐崖樽泶笫蠛?，斷頭處死，剪取0.5 g腦組織，加入1 mL裂解液，制備為勻漿液，在4 ℃、3 000 r/min下離心20 min，收集上清，在-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 大鼠血清色氨酸、TNF-α、IL-6水平及腦組織5-HT水平檢測 取出“2.3”項下大鼠血清及腦組織樣品液，置于冰水浴中緩慢解凍，采用ELISA法分別檢測血清色氨酸、TNF-α、IL-6水平和腦組織中5-HT水平，操作步驟參照相關試劑盒說明書進行。

2.5 大鼠血清MDA水平、SOD活性檢測 取出“2.3”項下血清，置于冰水浴中緩慢解凍，參照各自試劑盒說明書檢測血清MDA水平、SOD活性。

3 結果

3.1 鼠尾懸掛實驗 與對照組比較，模型組大鼠靜止不動時間延長(P<0.05)；與模型組比較，安神定志方各劑量組及蓯蓉益腎顆粒組大鼠靜止不動時間縮短(P<0.05)，并呈劑量依賴性(P<0.05)；與蓯蓉益腎顆粒組比較，安神定志方高劑量組大鼠靜止不動時間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組大鼠靜止不動時間比較

3.2 冷水竭力游泳實驗 與對照組比較，模型組大鼠游泳時間縮短(P<0.05)；與模型組比較，安神定志方各劑量組及蓯蓉益腎顆粒組大鼠游泳時間延長(P<0.05)，并呈劑量依賴性(P<0.05)；與蓯蓉益腎顆粒組比較，安神定志方高劑量組大鼠游泳時間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 各組大鼠游泳時間比較

3.3 曠場實驗 與對照組比較，模型組大鼠跨格數(shù)降低(P<0.05)；與模型組比較，安神定志方各劑量組及蓯蓉益腎顆粒組大鼠跨格數(shù)升高(P<0.05)，并呈劑量依賴性(P<0.05)；與蓯蓉益腎顆粒組比較，安神定志方高劑量組大鼠跨格數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 各組大鼠跨格數(shù)比較

3.4 水迷宮實驗 與對照組比較，模型組大鼠水迷宮實驗中穿越原平臺位置次數(shù)降低(P<0.05)，平均逃避潛伏期升高(P<0.05)；與模型組比較，安神定志方各劑量組及蓯蓉益腎顆粒組大鼠水迷宮實驗中穿越原平臺位置次數(shù)升高(P<0.05)，平均逃避潛伏期降低(P<0.05)，并呈劑量依賴性(P<0.05)；與蓯蓉益腎顆粒組比較，安神定志方高劑量組大鼠水迷宮實驗中穿越原平臺位置次數(shù)和平均逃避潛伏期差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表4。

表4 各組大鼠平均逃避潛伏期及穿越原平臺位置次數(shù)比較

3.5 大鼠腦組織5-HT及血清色氨酸水平 與對照組比較，模型組大鼠腦組織5-HT及血清色氨酸水平升高(P<0.05)；與模型組比較，安神定志方各劑量組及蓯蓉益腎顆粒組大鼠腦組織5-HT及血清色氨酸水平降低(P<0.05)，并呈劑量依賴性(P<0.05)；與蓯蓉益腎顆粒組比較，安神定志方高劑量組大鼠腦組織5-HT及血清色氨酸水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表5。

表5 各組大鼠腦組織5-HT及血清色氨酸水平比較

3.6 大鼠血清氧化應激指標 與對照組比較，模型組大鼠血清MDA水平升高(P<0.05)，SOD活性降低(P<0.05)；與模型組比較，安神定志方各劑量組及蓯蓉益腎顆粒組大鼠血清MDA水平降低(P<0.05)，SOD活性升高(P<0.05)，并呈劑量依賴性(P<0.05)；與蓯蓉益腎顆粒組比較，安神定志方高劑量組大鼠血清MDA水平、SOD活性差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表6。

表6 各組大鼠血清氧化應激指標比較

3.7 大鼠血清TNF-α、IL-6水平 與對照組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-6水平升高(P<0.05)；與模型組比較，安神定志方各劑量組及蓯蓉益腎顆粒組大鼠血清TNF-α、IL-6水平降低(P<0.05)，并呈劑量依賴性(P<0.05)；與蓯蓉益腎顆粒組比較，安神定志方高劑量組大鼠血清TNF-α、IL-6水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表7。

表7 各組大鼠血清TNF-α、IL-6水平比較

4 討論

慢性疲勞綜合征屬于亞健康性疾病，又稱為肌痛性腦脊髓炎，是一種以反復持續(xù)發(fā)作的極度疲勞為主要臨床表現(xiàn)的全身性綜合征，除了肌肉關節(jié)痛、頭痛、食量減少、淋巴結腫大、反復性上呼吸道感染等軀體癥狀外，還伴有焦慮、抑郁、認知功能下降等中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，且與一般性疲勞不同，充分的休息并不能緩解CFS患者的癥狀[1-2,15]。本文采用慢性束縛和冷水力竭游泳相結合的方法制備CFS大鼠模型，結果發(fā)現(xiàn)建模大鼠體重明顯變輕、毛發(fā)稀疏泛黃、背部皮膚松弛、大便干結或稀溏，表現(xiàn)出精神萎靡、四肢蜷臥、飲食減少等疲勞癥狀；以鼠尾懸掛實驗、冷水竭力游泳實驗、曠場實驗、水迷宮實驗檢測大鼠運動行為能力。結果顯示，大鼠鼠尾懸掛實驗中靜止不動時間、水迷宮實驗中平均逃避潛伏期升高，冷水竭力游泳實驗中游泳時間、曠場實驗中跨格數(shù)、水迷宮實驗中穿越原平臺位置次數(shù)降低，表明大鼠經(jīng)慢性束縛和冷水力竭游泳處理后，學習記憶和運動能力減弱，表現(xiàn)出焦慮、精神萎靡、四肢倦怠等疲勞癥狀，揭示模型建立成功。

慢性疲勞綜合征在臨床中沒有明顯的實驗室檢查指標的異常，給西醫(yī)的治療帶來了困難，目前主要是針對抑郁、焦慮或失眠等的對癥治療，效果并不理想，因而中醫(yī)藥在CFS的治療中得到了廣泛的應用[10-11]。中醫(yī)認為慢性疲勞綜合征屬于“虛勞”“郁證”“內(nèi)傷發(fā)熱”等范疇，病位在肝、脾、腎，多慮、勞作過度或外邪侵襲致肝、脾、腎受損，致肝失疏泄、脾失運化、腎氣不充，進而導致氣血不足、陰陽兩虛，從而引發(fā)懈怠安臥、腦轉(zhuǎn)耳鳴、脛酸眩冒[16]。安神定志方出自清代《醫(yī)學心悟》，主要成分為遠志、石菖蒲、茯神、茯苓、龍齒、黨參。石菖蒲和遠志鎮(zhèn)驚安神、行氣解郁、除痰活血，龍齒、茯神定驚鎮(zhèn)心、寧心健脾，茯苓、黨參健脾和胃、利水滲濕、補中益氣，全方共湊健脾解郁、調(diào)理氣血、化痰行氣、安神利眠的功效，安神定志方還可抑制促炎因子表達，阻止炎癥發(fā)生發(fā)展，減輕阿爾茨海默病造成的神經(jīng)元損傷，提高大腦學習記憶能力，改善焦慮、抑郁及失眠癥狀[6-9]，因而推測安神定志方可能用于治療慢性疲勞綜合征。本文結果顯示，以不同劑量安神定志方處理CFS模型大鼠，可降低其靜止不動時間、平均逃避潛伏期，升高游泳時間、跨格數(shù)、穿越原平臺位置次數(shù)，并呈劑量依賴性，表明安神定志方可提高CFS大鼠學習記憶功能，改善其焦慮及疲勞癥狀，并修復其運動功能，且隨劑量升高而作用增強。

慢性疲勞綜合征的發(fā)病機制復雜，其中氧化應激水平增加、細胞免疫功能異常、神經(jīng)炎癥是重要的致病因素，高水平的氧化應激可導致外周組織細胞，特別是骨骼肌細胞的胞膜及DNA損傷，從而損傷患者運動功能，細胞免疫功能異常及凋亡脫落的細胞碎片可激活巨噬細胞，引發(fā)腦部炎癥反應，促使神經(jīng)元凋亡，損害中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能[17-19]。研究發(fā)現(xiàn)，以色氨酸為起始的5-HT系統(tǒng)功能紊亂是慢性疲勞綜合征的發(fā)病機制之一，慢性疲勞綜合征患者血中色氨酸水平明顯高于健康人群，分析認為，疲勞狀態(tài)下，機體脂肪動員增強，造成血中色氨酸水平升高，進入大腦代謝，在5-HT能神經(jīng)元內(nèi)合成5-HT，增加腦內(nèi)5-HT水平，最終引起5-HT系統(tǒng)功能紊亂[5,20]。本文結果顯示，CFS模型大鼠經(jīng)不同劑量安神定志方處理后，其血清色氨酸、MDA、TNF-α、IL-6水平及腦組織5-HT水平降低，血清SOD活性升高，并呈劑量依賴性，表明安神定志方可降低CFS大鼠氧化應激水平，抑制炎癥，減弱色氨酸代謝過程，改善大鼠運動功能，減輕其疲勞癥狀。

綜上所述，安神定志方可減弱氧化應激及炎癥反應，降低色氨酸代謝水平，修復CFS大鼠運動功能，改善其疲勞癥狀，為慢性疲勞綜合征的臨床治療提供了新的參考。但本文僅對表面現(xiàn)象進行了初步研究，安神定志方具體是通過哪些信號通路起作用的，還未涉及，有待后續(xù)深入研究其分子機制。