蛇床子素對特異性皮炎小鼠皮膚屏障及慢性瘙癢的作用

陳姣蓉，洪小平，段妍君，張彥紅，韓永明

(湖北中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖組胚教研室，湖北 武漢 430065)

特異性皮炎(atopic dermatitis，AD)為一種伴隨嚴(yán)重瘙癢的炎癥性皮膚病，其具有發(fā)病機(jī)制多、發(fā)病率高、病情易反復(fù)等特點。目前認(rèn)為，遺傳、環(huán)境、免疫及皮膚屏障的破壞參與了特異性皮炎的發(fā)生機(jī)制[1]。臨床治療從改善皮膚屏障和緩解皮膚搔抓次數(shù)為主要原則，但目前尚缺乏安全有效的藥物，多采用保濕制劑或抗生素、激素類藥物緩解癥狀[2]。隨著對中藥學(xué)研究的深入，發(fā)現(xiàn)許多止癢方劑在止癢上有重要價值，其中以蛇床子使用頻率最高，甚至有研究發(fā)現(xiàn)蛇床子具有修復(fù)皮膚屏障的作用[3]。中醫(yī)學(xué)中提到，蛇床子內(nèi)外俱可施治，以外治尤良，具有抗炎、抗病毒、抗過敏等多種作用[4]。蛇床子在心肌梗死[5]、食管鱗癌[6]等多種疾病中參與抗炎、抗細(xì)胞凋亡作用，但關(guān)于蛇床子在特異性皮炎中是否發(fā)揮皮膚屏障保護(hù)的作用仍需要更多的研究數(shù)據(jù)來證實。聚絲蛋白和緊密連接蛋白是皮膚屏障中研究最多的對象，因此本研究通過小鼠實驗來確定蛇床子對AD小鼠模型皮膚屏障和炎癥的改善是否產(chǎn)生積極影響,以期為臨床治療提供新的策略依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞株 人角質(zhì)細(xì)胞(HaCaT細(xì)胞)，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞庫提供，在含10%胎牛血清AMEM培養(yǎng)基中、在37 ℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)。

1.2 動物 無特定病原級的雄性BALB/c小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量20～30 g，購自湖北奧菲生物科技有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(鄂)2019-0024，動物實驗批準(zhǔn)號IACUC20190306，于湖北中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物研究中心完成實驗，實驗環(huán)境為溫度(20±2)℃，相對濕度45%～50%，12 h/12 h明暗交替，自由攝食飲水。

1.3 試劑與藥物 噁唑酮液配制方法為將80%丙酮和20%橄欖油混合物作為溶劑，與2%噁唑酮按一定比例混合，分別配制成0.5%、0.2%致敏液，4 ℃避光保存。蛇床子素(純度≥98%，美國Clontech公司)，在4 ℃冰箱中避光保存。p-Akt激動劑SC79(純度98%，上海滬震實業(yè)有限公司)，取3.65 mg SC79加入10% DMSO溶液和90%玉米油1 mL配制成10 mmol/L溶液。噁唑酮、橄欖油、丙酮(深圳市瑞沃德生命科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)>50%)；10%胎牛血清、PBS溶液(四川訊麥科技有限公司)；RNA提取試劑盒(北京莊盟國際生物基因科技有限公司)；TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒、p-Akt一抗、p-Erk一抗(日本TaKaRa公司)；4%多聚甲醛(北京索萊寶科技有限公司)；RIPA蛋白裂解液(上海艾研生物科技有限公司)。

1.4 儀器 實時熒光定量PCR儀(德國Leica公司)；WJ-3-160T型CO2培養(yǎng)箱(上海新諾儀器設(shè)備有限公司)；熒光顯微鏡(美國ABI公司)；索尼A7M3高清相機(jī)(日本SONY公司)。

2 方法

2.1 分組與造模 30只小鼠隨機(jī)分為空白組、AD組(模型組，激動劑組，蛇床子素低、高劑量組)，每組6只，實驗前1 d剃毛刀除去背部毛發(fā)，確定皮損區(qū)域面積約為2 cm×4 cm，適應(yīng)3 d。第4天，空白組小鼠背部剃毛部位均勻涂抹溶劑150 μL致敏，AD組小鼠均勻涂抹0.5%噁唑酮液150 μL致敏，每組2次。第5天，空白組小鼠取溶劑50、20 μL分別均勻涂抹于背部和右側(cè)耳部，AD組小鼠取0.2%噁唑酮液50、20 μL分別均勻涂抹于背部和右側(cè)耳部，適應(yīng)2 d。第7天，空白組小鼠不作其他處理，激動劑組小鼠腹腔注射50 mg/kg p-Akt激動劑SC79，模型組小鼠注射蒸餾水30 mg，蛇床子素低、高劑量組小鼠分別腹腔注射提取物0.3、0.9 mg，此后每48 h注射1次(第11、14天)，最后第21、28天分別刺激1次(空白組小鼠取溶劑50、20 μL，AD組小鼠取0.2%噁唑酮液50、20 μL均勻涂抹于背部和右側(cè)耳部)以維持皮損持續(xù)存在。第29天進(jìn)行背部皮損嚴(yán)重程度評分，測定搔抓次數(shù)，采集血清后處死小鼠，留取皮損組織標(biāo)本并分為3份，1份置于凍存管中加入一定量的Trizol，完全浸泡皮膚組織，-80 ℃保存，用于RT-qPCR檢測；另外2份常溫保存于10%甲醛中，用于病理及免疫組化檢測。

2.2 皮損評分、搔抓次數(shù)測定 肉眼觀察并記錄小鼠背部及耳部皮損癥狀，采用皮損嚴(yán)重程度評分進(jìn)行評價，包括紅斑、滲出、脫屑、苔蘚樣變，0～3分分別表示無皮疹、輕度皮疹、中度皮疹、重度皮疹。實驗結(jié)束后，記錄每只小鼠10 min內(nèi)對自身耳部及背部的搔抓次數(shù)，連續(xù)搔抓計為1次。

2.3 RT-qPCR法檢測緊密蛋白的mRNA表達(dá) 組織中加入1 mL Trizol，吹打混勻后轉(zhuǎn)入1.5 mL EP管中，漩渦振蕩器充分振蕩，室溫下放置5 min以使細(xì)胞充分裂解，加入氯仿200 μL，劇烈振蕩15 s使其呈乳糜狀，室溫下靜置3 min，分層后4 ℃、12 000 r/min離心15 min，吸取最上層清亮液體400 μL至1.5 mL DEPC處理過的EP管中，依次加入異丙醇400 μL、75%乙醇1 mL，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，反復(fù)吹打使沉淀充分溶解，提取各組細(xì)胞總RNA，檢測Cldn-1、Cldn6、Cldn-23、ZO-1、ZO-2、ZO-3、ZO-4 mRNA表達(dá)。

采用Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列見表1，95 ℃預(yù)變性15 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s，循環(huán)45次。以GAPDH為內(nèi)參，按照2-△△CT法計算組細(xì)胞中緊密連接蛋白mRNA表達(dá)。

表1 引物序列

2.4 Western blot檢測PI3K/Akt通路蛋白表達(dá) 組織剪碎，加RIPA裂解液充分裂解后置于組織勻漿器中，10 000 r/min離心5 min，取總蛋白上樣，電泳，切膠，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，選擇濕轉(zhuǎn)，TBS-T在25 ℃下封閉1 h，加入p-Akt一抗、p-ERK一抗(1∶500)、GAPDH一抗(1∶2 000)，4 ℃搖床過夜，PBST洗膜，加二抗(1∶2 000)，4 ℃搖床過夜，PBST洗膜，ECL發(fā)光試劑盒顯色、顯影，以GAPDH為內(nèi)參蛋白，通過Image Quant TL軟件分析各條帶的灰度值。

3 結(jié)果

3.1 小鼠皮損評分、搔抓次數(shù) 模型組小鼠皮損評分、搔抓次數(shù)高于空白組(P<0.05)；與模型組比較，激動劑組，蛇床子素低、高劑量組小鼠皮損評分、搔抓次數(shù)均降低(P<0.05)，激動劑組小鼠皮損評分、搔抓次數(shù)高于蛇床子素低、高劑量組(P<0.05)，蛇床子素低劑量組皮損評分、搔抓次數(shù)高于蛇床子素高劑量組(P<0.05)，見表2。

表2 各組小鼠皮損評分、搔抓次數(shù)比較

3.2 小鼠緊密連接蛋白mRNA表達(dá) 與空白組比較，模型組小鼠Cldn-1、Cldn6、Cldn-23、ZO-1、ZO-2、ZO-3、ZO-4 mRNA表達(dá)降低(P<0.05)，Cldn-5、Cldn-15、JAM-1、JAM-2 mRNA表達(dá)升高(P<0.05)；與模型組比較，激動劑組，蛇床子素低、高劑量組小鼠Cldn-1、Cldn6、Cldn-23、ZO-1、ZO-2、ZO-3、ZO-4 mRNA表達(dá)升高(P<0.05)，Cldn-5、Cldn-15、JAM-1、JAM-2 mRNA表達(dá)降低(P<0.05)；蛇床子素低、高劑量組小鼠Cldn-1、Cldn6、Cldn-23、ZO-1、ZO-2、ZO-3、ZO-4 mRNA表達(dá)高于激動劑組，Cldn-5、Cldn-15、JAM-1、JAM-2 mRNA表達(dá)低于激動劑組(P<0.05)，見圖1。

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與激動劑組比較，▲P<0.05。圖1 各組小鼠緊密連接蛋白mRNA表達(dá)

3.3 小鼠PI3K相關(guān)蛋白表達(dá) 與空白組比較，模型組小鼠p-Akt蛋白條帶信號增強(qiáng)，p-ERK蛋白條帶信號無變化；與模型組比較，激動劑組，蛇床子素低、高劑量組小鼠p-Akt蛋白條帶信號減弱，見圖2。與空白組比較，模型組小鼠p-Akt表達(dá)升高(P<0.05)，激動劑組，蛇床子素低、高劑量組p-Akt表達(dá)低于模型組(P<0.05)，激動劑組p-Akt表達(dá)高于蛇床子素低、高劑量組(P<0.05)，蛇床子素低劑量組與蛇床子素高劑量組p-Akt表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，空白組，模型組，激動劑組，蛇床子素低、高劑量組p-ERK表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

圖2 各組PI3K相關(guān)蛋白表達(dá)

表3 各組PI3K相關(guān)蛋白表達(dá)比較

4 討論

近年，聚絲蛋白和緊密蛋白在皮膚屏障中的作用研究較多，緊密蛋白位于皮膚屏障系統(tǒng)的中心位置，為皮膚屏障系統(tǒng)調(diào)節(jié)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，能夠?qū)Υ碳ぷ龀龇浅Ｑ杆俚姆磻?yīng)，其功能或水平的改變均可引起皮膚組織缺水、脫水、pH值異常及皮膚屏障功能破壞[7-8]。本研究中表現(xiàn)為皮膚屏障破壞和瘙癢相關(guān)癥狀，考慮小鼠缺乏緊密連接蛋白(Cldn、JAM、ZO)后，離子和大分子的細(xì)胞外滲透而出現(xiàn)皮膚屏障受損[9]。Cldn-1可影響角質(zhì)層水屏障功能，參與大分子緊密連接屏障形成。Su等[10]指出，特異性皮炎患者皮膚中緊密連接蛋白Cldn-1、Cldn-6、Cldn-8、Cldn-19、Cldn-23下調(diào)，顯著影響了皮膚緊密連接功能。特異性皮炎病灶皮膚汗腺Cldn-1下調(diào)，且Nattkemper等[11]證實了Cldn-1可預(yù)防汗腺滲漏。ZO-3僅在上皮細(xì)胞中表達(dá)，參與形成細(xì)胞間緊密連接，付莉慧等[12]發(fā)現(xiàn)ADF模型小鼠皮膚中ZO-3下調(diào)且參與細(xì)胞間緊密連接蛋白的形成。Akt信號通路和ERK信號通路與緊密連接蛋白表達(dá)相關(guān)，為探索AD小鼠模型中參與調(diào)節(jié)緊密連接蛋白表達(dá)的信號通路，取小鼠皮膚樣本對p-Akt和p-ERK表達(dá)進(jìn)行檢測，結(jié)果AD模型小鼠皮膚中PI3K/Akt通路中的關(guān)鍵蛋白p-Akt上調(diào)而p-ERK無顯著變化，提示PI3K/Akt信號通路與特異性皮炎發(fā)生相關(guān)，參與了人角質(zhì)形成細(xì)胞間緊密連接的形成和AD皮膚平衡的破壞，這與胡雪勤[13]的報道結(jié)果一致。同時，激動劑組小鼠p-Akt的變化趨勢與低劑量組、高劑量組一致，p-Akt激動劑可發(fā)揮改善緊密連接的作用。激動劑組小鼠抓癢次數(shù)和皮損評分較模型組小鼠得到顯著改善，說明Akt信號通路參與調(diào)節(jié)AD模型小鼠瘙癢癥狀。

蛇床子素治療后小鼠皮損程度和搔抓次數(shù)均得到顯著改善，該變化隨著藥物的累積呈漸進(jìn)式改善，且高劑量組小鼠的改善效果優(yōu)于低劑量組。蛇床子素作用于小鼠后，其各連接蛋白mRNA表達(dá)異常下調(diào)，其中以ZO-3下調(diào)最明顯；同時，蛇床子素的應(yīng)用降低了p-Akt表達(dá)，且這種作用呈劑量依賴。本研究結(jié)果證實了蛇床子素對AD模型小鼠的皮膚屏障和慢性搔抓次數(shù)均有顯著影響，其可改善AD小鼠皮膚屏障破壞，這與既往報道結(jié)果一致[14-16]。根據(jù)Yao等[14]的文獻(xiàn)結(jié)果，這與蛇床子素介導(dǎo)了多種炎癥因子有較大關(guān)系?？琢恋萚15]指出，蛇床子素對開放性腦損傷的小鼠具有一定的治療作用,可能是通過減少炎癥細(xì)胞浸潤和細(xì)胞凋亡發(fā)揮治療作用。李曉婷等[16]報道，蛇床子素可直接作用于而產(chǎn)生抗炎作用。

綜上所述，蛇床子素可通過介導(dǎo)PI3K/Akt通路調(diào)控AD小鼠模型皮膚中緊密連接蛋白表達(dá)，可改善皮膚屏障受損、減輕慢性搔抓次數(shù)，為特異性皮炎治療提供了更有利的臨床依據(jù)。