食品黃曲霉毒素總量檢測方法的研究與應(yīng)用

摘要：在當(dāng)前新時代背景下，民眾對食品安全問題的重視程度不斷提升，在此背景影響下，我國科研界也加大了對食品安全檢測技術(shù)的研力度。黃曲霉毒素（AF）對人體健康存在較強(qiáng)的威脅，因此，研究人員對食品黃曲霉毒素檢測技術(shù)的研究較為深入。考慮到黃曲霉毒素對人體的危害性以及其存在的廣泛性，以往單一的檢測技術(shù)已經(jīng)難以滿足實(shí)際應(yīng)用需求，因此現(xiàn)階段針對黃曲霉毒素的檢測技術(shù)呈現(xiàn)出多元發(fā)展趨向，現(xiàn)有技術(shù)可分為生物分析法、理化分析法、免疫分析法等幾項類別，在實(shí)際應(yīng)用過程中取得了較大成效。基于此，本文以堅果食品為例，分析高效液相色譜法在檢測食品中黃曲霉毒素的應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：黃曲霉毒素;高效液相色譜法;應(yīng)用

中圖分類號：R155.5

0引言

黃曲霉毒素是一種由黃曲霉及寄生曲霉在聚酮作用影響下產(chǎn)生的有毒次生代謝物，它對人體造成的實(shí)際危害包括慢性中毒、生長障礙、癌癥等?，F(xiàn)階段，技術(shù)人員在對其進(jìn)行充分研究后，分離并鑒定出12種對人體威脅較大的黃曲霉毒素，存在與谷物、堅果等食品之中。從實(shí)際情況分析，黃曲霉毒素的產(chǎn)生菌廣泛存在于自然界中，這就導(dǎo)致黃曲霉毒素污染可能產(chǎn)生在食品生產(chǎn)的任意一個環(huán)節(jié)之中[1]。針對黃曲霉毒素最好的處理方案即是消除污染源，最大程度上避免黃曲霉毒素污染食品。目前國內(nèi)外研究界已經(jīng)將食品黃曲霉毒素總量檢測技術(shù)作為重點(diǎn)研究課題之一。

1高效液相色譜法原理概述

從本質(zhì)層面分析，高效液相色譜法的原理為在適當(dāng)?shù)亓鲃酉鄺l件下，利用反相C18色譜柱對經(jīng)過凈化的樣品黃曲霉毒素總量進(jìn)行分離操作，隨后針對黃曲霉毒素所具備的熒光特性，采用熒光檢測器對其進(jìn)行定性以及定量檢測。西方研究者者RAO等在1973年建立高效液相色譜法，該方法的優(yōu)勢在于可以同時針對B1、B2、G1、G2這四種黃曲霉毒素進(jìn)行檢測，檢測量可以達(dá)到1μg/kg。研究界在他們的研究成果上不斷進(jìn)行深化，發(fā)展出正相以及反相液相色譜法兩種類別，其中反相色譜檢測法在靈敏性以及穩(wěn)定性方面具備更強(qiáng)的優(yōu)勢，但也存在一定的短板，實(shí)際檢測過程中可以有效針對B2、G2進(jìn)行檢測，但B1、G1在含水溶劑中，其熒光出現(xiàn)淬滅的幾率較大，進(jìn)而導(dǎo)致無法有效檢測，因此實(shí)際進(jìn)行過程中需要進(jìn)行柱前或是柱后衍生，易達(dá)成增強(qiáng)分子熒光強(qiáng)度的目的。

高效液相色譜法的優(yōu)勢在于分辨率高，靈敏性強(qiáng)，實(shí)際應(yīng)用過程中可以有效保障檢測結(jié)果的可靠性，同時可以利用信息系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)自動化操作，適用于對大批量樣品進(jìn)行定性、定量以及多元分析，現(xiàn)階段該方法是當(dāng)前國內(nèi)外食品黃曲霉毒素總量檢測的權(quán)威方法[2]。但是該方法同樣具備一定短板，即對精密設(shè)備要求較高且價格昂貴，對檢測人員的技術(shù)水平具有較高要求，同時樣本需要進(jìn)行前處理，無法應(yīng)用于需要進(jìn)行快速、現(xiàn)場檢測的場合。

2食品黃曲霉毒素總量檢測條件概述

本文所研究的技術(shù)為針對堅果食品黃曲霉毒素總量檢測的免疫親和柱凈化高效液相色譜法，試驗中應(yīng)用的色譜儀設(shè)備以及熒光檢測設(shè)備為日本HITACHI公司產(chǎn)品;高速勻質(zhì)器性能為18000～22000r/min，采用Warning公司產(chǎn)品;6位泵流操作架以及光化學(xué)柱衍生器采用國產(chǎn)設(shè)備，由北京中檢健康技術(shù)有限公司生產(chǎn);C-18柱采用美國clover公司生產(chǎn)設(shè)備。

試驗所用試劑主要包括黃曲霉毒素總量免疫親和柱以及黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2標(biāo)準(zhǔn)品兩種，分別為北京中檢健康技術(shù)有限公司以及美國supeleco公司產(chǎn)品。

本次試驗中主要針對色譜柱、流動相以及流速等條件進(jìn)行設(shè)置。試驗中所用色譜柱規(guī)格為4.6mm×150mm，5μg;流動相設(shè)置為甲醇—水，二者之間的比例為45：55;試驗流速設(shè)定為0.8mL/min。本次試驗過程中對熒光檢測器激發(fā)波長以及發(fā)射波長進(jìn)行設(shè)置，標(biāo)準(zhǔn)分別為360nm以及440nm[3]。進(jìn)樣體積控制在20～100μL區(qū)間范圍內(nèi)。

3檢測試驗過程

本次試驗的目的為利用免疫親和柱凈化高效液相色譜法對堅果食品黃曲霉毒素總量進(jìn)行檢測，在實(shí)際試驗過程中需要首先對黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行配置并構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。在操作過程中將B1、B2、G1、G2進(jìn)行混合配置并將其濃度調(diào)配為2600μg/L。其中B1、G1以及B2、G2的濃度存在差異，分別為1000μg/L以及300μg/L。隨后試驗人員利用流動相對標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行配置，混合標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度依次為2.6、13、26、52、104μg/L，隨后將其注入至液相色譜檢測儀中，并針對B1、B2、G1、G2分別建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

在完成黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品的配置工作后，需要對樣品進(jìn)行處理。實(shí)際處理過程中需要首先對樣品進(jìn)行磨細(xì)處理，確保其粒度控制在2mm以下，隨后精準(zhǔn)稱取50g樣品將其至于250ml具塞錐形瓶中，加入氯化鈉以及流動相，其規(guī)格分別為5g以及100mL，完成此項操作后使用均質(zhì)器對其進(jìn)行高速攪拌提取處理，時間控制在2min。隨后利用定量濾紙進(jìn)行過濾，對濾液進(jìn)行移取處理，移取量應(yīng)精準(zhǔn)控制在10mL，并加入40mL純水以達(dá)成稀釋目的，隨后利用玻璃纖維濾紙再次進(jìn)行過濾[5]。

免疫親和柱應(yīng)與10mL玻璃注射器相連接，并將其放置在6位泵流操作架之上，隨后取10mL樣品處理液并將其注入至玻璃注射器之中，利用空氣壓力泵設(shè)備推動溶液以1滴/s的流速通過免疫親和柱，2～3mL空氣通過柱體即可關(guān)閉壓力泵。用10mL純水對柱體進(jìn)行淋洗處理，反復(fù)操作兩次并確保全部流出液均已棄流，隨后再次推動2～3mL空氣通過柱體。之后取2mL色譜級甲醇開展洗脫處理，此過程中應(yīng)注意將流速控制在1滴/s，同時應(yīng)對洗脫液進(jìn)行收集并進(jìn)行混勻處理，隨后注入高效液相色譜儀進(jìn)行檢測。

樣品處理步驟完成后，即可開展添加回收實(shí)驗。試驗中選擇花生、核桃、腰果作為樣品開展試驗，分別對不同樣品添加B1、B2、G1、G2混合標(biāo)準(zhǔn)品，質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度設(shè)定為5.2，26，52μg/kg，不同梯度應(yīng)分別進(jìn)行5組平行試驗，隨后對回收率以及精密度進(jìn)行計算。

4檢測試驗結(jié)果分析

4.1光化學(xué)衍生器衍生成效

在實(shí)際開展本次試驗過程中充分認(rèn)識到B1、G1在遇水后其熒光產(chǎn)生淬滅的幾率較大，進(jìn)而出現(xiàn)液相色譜檢測法失效的情況，因此，決定采用光化學(xué)衍生提升B1、G1熒光性的方式，極大地提升了檢測靈敏性以及有效性。從實(shí)際結(jié)果分析，在26μg/L質(zhì)量濃度條件下，經(jīng)過光化學(xué)衍生加強(qiáng)后B1、G1熒光性得到顯著增強(qiáng)。圖1中（a）與（b）分別為26μg/L質(zhì)量濃度條件下未經(jīng)光化學(xué)衍生增強(qiáng)以及經(jīng)過光化學(xué)衍生增強(qiáng)的色譜圖。

4.2標(biāo)準(zhǔn)曲線

本文所研究試驗中，配置了2.6、13、26、52、104μg/L質(zhì)量濃度的黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)品，將其分別注入液相色譜檢測后，針對B1、B2、G1、G2分別建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。從最終結(jié)果分析可知，B1、B2、G1、G2四種標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度及其峰面積之間呈現(xiàn)出較好的線性關(guān)系。表1為黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)現(xiàn)行回歸方程。

4.3樣品添加回收率及精密度

本文所研究試驗選取花生、核桃、腰果作為樣品開展黃曲霉毒素總量檢測試驗，試驗過程中分別在樣品中添加不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品，分別為5.2、26以及52μg/kg，最終測定結(jié)果如下：花生樣品的回收率以及精密度區(qū)間范圍分別為85%～94.5%以及2.98%～6.54%;核桃樣品的回收率以及精密度區(qū)間范圍分別為83.2%～94.2%以及1.65%～6.32%;花生樣品的回收率以及精密度區(qū)間范圍分別為81.3%～96%以及3.54%～6.13%[6]。

樣品中測定的B1、B2、G1、G2加標(biāo)回收率以及精密度結(jié)果如表2所示。

依據(jù)試驗結(jié)果可知，在10倍信噪比計算定量限條件下，確定黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的方法靈敏度，分別為0.1μg/kg、0.05μg/kg、0.1μg/kg、0.15μg/kg。

以花生樣品為例，其在添加質(zhì)量濃度為26μg/L的黃曲霉毒素標(biāo)品后測得的色譜圖如圖1所示。

5總結(jié)

綜上所述，本文所研究的免疫親和柱凈化—高效液相色譜法在檢測黃曲霉毒素過程中具備操作簡便的優(yōu)勢，同時凈化過程也取得了預(yù)期成效。運(yùn)用光化學(xué)衍生方式提升黃曲霉毒素B1、G1的熒光性后，該方法的檢測有效性得到了極大的提高。在1.0～40.0μg/L（B1，G1）以及0.3～12.0μg/L（G1，G2）線性范圍內(nèi)，所得回歸方程的相關(guān)系數(shù)均大于0.9999。經(jīng)過實(shí)際檢測后，可以得出樣品的回收率控制在81.3%～96.0%范圍內(nèi)以及精密度小于10%的結(jié)論，同時，試驗數(shù)據(jù)表明其靈敏度很高。本方法試劑用量少、準(zhǔn)確度高、靈敏度高，可以有效應(yīng)用于堅果食品中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2總含量的檢測。

參考文獻(xiàn)

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作者簡介：劉揚(yáng)（1991-），女，遼寧本溪人，工程師，漢族，碩士研究生，畢業(yè)于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，食品科學(xué)專業(yè)，主要從事食品質(zhì)量檢驗檢測工作。