青錢柳幼嫩與成熟葉片代謝組學(xué)數(shù)據(jù)比較分析

林偉達(dá)，李鈞敏

（1.臺州科技職業(yè)技術(shù)學(xué)院 人文教育學(xué)院，浙江 臺州 318000；2.臺州學(xué)院 浙江省植物進(jìn)化生態(tài)學(xué)與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 臺州 318000）

0 前言

青錢柳（Cyclocarya paliurus（Batal）Ijinskaja）又名青錢李、搖錢樹，是胡桃科（Juglandaceae）青錢柳屬（Cyclocarya）植物。青錢柳是單種屬植物，為第四紀(jì)冰期孑遺物種，是我國特有的珍稀瀕危保護(hù)植物［1?2］。

據(jù)《中國中藥志要》記載，青錢柳樹皮、樹葉具有清熱解毒、止痛功能，可用于治療頑癬。民間常用其葉片做茶，因其味甜有清熱解暑、降糖、降壓的功效，又稱為甜茶、神茶等［3］。有關(guān)青錢柳化學(xué)成分及藥效的研究始于20世紀(jì)70年代，對其理化成分及藥理作用研究則始于20世紀(jì)80年代中期［4］。研究發(fā)現(xiàn)飲用青錢柳葉茶能抑制人體對葡萄糖的吸收，有效控制糖尿病患者的血糖水平，提高對葡萄糖的糖耐量，又可以使病變的胰島結(jié)構(gòu)功能逐步得到恢復(fù)［5?7］。多年研究發(fā)現(xiàn)青錢柳主要含有多糖、黃酮、三萜皂苷、微量元素等化學(xué)成分，具有多方面的藥理活性，尤其在降血糖和降血脂方面具有獨(dú)特的療效［5，8?12］。2013年10月，國家衛(wèi)計(jì)委批準(zhǔn)青錢柳葉加入新資源食品目錄［13］。

代謝組學(xué)能夠定性定量地分析生物體在某一特定生理時(shí)期內(nèi)（如將某個(gè)特定的基因變異或環(huán)境變化后）的代謝產(chǎn)物的變化或其隨時(shí)間的變化，從而研究生物體的代謝途徑［14］。通過植物代謝組學(xué)的研究，可以了解同一植物的不同時(shí)期或不同部位的代謝途徑及代謝物含量變化，能夠提高植物產(chǎn)品品質(zhì)［15］。范文強(qiáng)等［16］利用代謝組學(xué)研究表明中花期收獲的苜蓿更宜青貯，而現(xiàn)蕾期收獲的苜蓿更宜調(diào)制干草。郝亞利［14］通過代謝組學(xué)揭示了氨基酸、黃酮、兒茶素等代謝產(chǎn)物在不同葉齡茶鮮葉中含量變化，有助于茶葉的品種改良和鮮葉品質(zhì)調(diào)控。Tajidin等［17］利用代謝組學(xué)分析穿心蓮幼葉和成熟葉的代謝產(chǎn)物差異，結(jié)果表明第18周收獲的穿心蓮幼葉可作為生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)植物提取物的最佳原材料。Lawal等［18］提出植物代謝物含量的可變性可能受到多種因素的影響，包括植物的收獲年齡階段。

有關(guān)青錢柳葉片不同發(fā)育階段代謝組學(xué)的相關(guān)研究報(bào)道并不多，僅見本實(shí)驗(yàn)室基于高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatography tandem mass spectrometry technology，LC-MS-MS）技術(shù)，利用代謝組學(xué)分析了四個(gè)不同發(fā)育階段青錢柳葉片黃酮類化合物［19］和酚酸類化合物［20］組成，并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析了可能的黃酮類化合物、酚酸類化合物的合成代謝途徑，為青錢柳葉片相關(guān)代謝物的綜合利用提供了理論依據(jù)。在青錢柳葉片的加工過程中，青錢柳的幼嫩葉片常用于開發(fā)青錢柳茶葉，而成熟的葉片常用于開發(fā)青錢柳葉片相關(guān)產(chǎn)品，但這種利用方式缺乏具體的理論依據(jù)。本文基于LC-MS-MS技術(shù)，比較分析了青錢柳幼嫩與成熟葉片氨基酸、黃酮、三萜類化合物等主要化學(xué)成分的差異，旨在為青錢柳葉片的分類利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料

春茶是一年中最優(yōu)質(zhì)的季節(jié)茶，谷雨前后的茶葉品質(zhì)更好［21?22］，因此在2018年5月1日，從浙江省麗水市龍泉市朱章村（E118°48＇28＇＇，N28°5＇57＇＇）采集青錢柳葉片，幼葉指最小的完全展開的葉子，成熟葉指達(dá)到全葉大小和全葉厚度的葉子。從株高、冠徑等長勢相似，生長位置相近的三株植物中采集樣本，產(chǎn)生了三個(gè)生物重復(fù)用于代謝組分析。所有樣品收集后立即用液氮冷凍并儲存在-80℃直至進(jìn)一步分析。

1.2 代謝物提取

將氧化鋯珠添加到凍干的葉子中，然后使用混合研磨機(jī)（MM400，Retsch，Haan，Germany）在30 Hz條件下粉碎1.5 min。稱取粉末100 mg，加入1 mL 70%甲醇水溶液，4℃萃取過夜。萃取液以10，000×g離心 10 min 后，上清液提取物被吸收（CNWBONDCarbon GCB SPE Cartridge，250 mg，3 mL；ANPEL，中國上海）并過濾（SCAA-104，0.22μm孔徑；ANPEL，中國上海），然后進(jìn)行LC-MS分析。

1.3 質(zhì)譜和色譜條件

采用超高效液相色譜（Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC）（Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM30A）和串聯(lián)質(zhì)譜（Tandem mass spectrometry，MS/MS；Applied Biosystems 6500 QTRAP）進(jìn)行LC-MS分析。使用以下分析條件：色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18（1.8μm，2.1 mm×100 mm）；流動(dòng)相：水相為超純水（加入0.04%的乙酸），有機(jī)相為乙腈（加入0.04%的乙酸）；洗脫梯度：0 min 水/乙腈（95:5 V/V），11.0 min 為 5:95 V/V，12.0 min為 5:95 V/V，12.1 min為 95:5 V/V，15.0 min為95:5 V/V；流速0.4 mL/min；柱溫40℃；進(jìn)樣量2μL。流出物交替連接到ESI-三重四極桿線性離子阱（Q TRAP）-MS。線性離子阱（LIT）和三重四極桿（QQQ）掃描是在配備 ESI Turbo離子噴霧接口的API 6500 Q TRAP LC/MS/MS系統(tǒng)的三重四極桿線性離子阱質(zhì)譜儀（Q TRAP）上采集的，在正離子模式下運(yùn)行并由Analyst 1.6軟件（AB Sciex，Concord，Ontario，Canada）控制。質(zhì)譜條件主要包括：電噴霧離子源溫度500℃，質(zhì)譜電壓5500 V，簾氣25 psi，碰撞誘導(dǎo)電離參數(shù)設(shè)置為高。

1.4 數(shù)據(jù)分析

質(zhì)譜數(shù)據(jù)由Analyst 1.6軟件和MultiaQuant軟件進(jìn)行峰面積匹配和積分。使用R軟件的prcomp函數(shù)和MetaboAnalystR函數(shù)進(jìn)行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）。采用OPLS-DA模型得到的變量權(quán)重值（VIP）≥1，并結(jié)合單變量分析的差異倍數(shù)值（fold change）≥2或≤0.5來篩選差異表達(dá)代謝物。

2 結(jié)果與分析

2.1 幼嫩與成熟葉片代謝組學(xué)數(shù)據(jù)概況

對幼嫩葉片和成熟葉片的代謝組數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA分析，PCA得分如圖1所示。由圖1可知，在主成分1和主成分2維圖上幼嫩葉片和成熟葉片之間有明顯的分離趨勢，表明兩個(gè)樣本之間的代謝物發(fā)生了明顯變化。

圖1 幼嫩葉和成熟葉樣品的主成分分析得分圖

通過火山圖（如圖2所示）可以快速地查看代謝物在兩組樣品中含量的差異，以及差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。由圖2可知，在兩組樣本之間共檢測到695個(gè)代謝物，其中成熟葉片相比于幼嫩葉片共有94個(gè)代謝物含量顯著上升，131個(gè)代謝物含量顯著下降，470個(gè)代謝物在兩組樣品之間并無顯著差異。其中變化最多的黃酮類化合物，其次為氨基酸及其衍生物，如表1所示。

圖2 幼嫩葉和成熟葉樣品數(shù)據(jù)火山圖

表1 青錢柳幼嫩葉和成熟葉之間具有顯著差異的代謝物數(shù)量

2.2 幼嫩與成熟葉片氨基酸組成比較

在幼嫩葉片和成熟葉片中共檢測到12種具有顯著差異表達(dá)的氨基酸，其中包括了苯丙氨酸和色氨酸兩種人體必需氨基酸，如表2所示。12種氨基酸在幼嫩葉片中的表達(dá)含量均顯著高于成熟葉片，其中精氨酸下調(diào)至原來的0.8%，瓜氨酸下調(diào)至原來的0.01%。

表2 幼嫩葉片和成熟葉片之間具有顯著差異的氨基酸

2.3 幼嫩與成熟葉片黃酮類化合物組成比較

在幼嫩葉片和成熟葉片中共檢測到45種具有顯著差異表達(dá)的黃酮類化合物，如表3所示。在黃酮化合物中，12種化合物在幼嫩葉中的表達(dá)含量顯著高于成熟葉片，7種化合物在成熟葉片中的表達(dá)含量顯著高于幼嫩葉片。其中3′，4′，5′-二氫三羥黃酮O-二己糖苷、麥黃酮O-芥子酰己糖苷和櫻花素僅在成熟葉中檢測到，金圣草黃素5-O-己糖苷僅在幼嫩葉中檢測到。在黃酮醇類化合物中，7種化合物在幼嫩葉片中的表達(dá)含量顯著高于成熟葉片，7種化合物在成熟葉片中的表達(dá)含量顯著高于幼嫩葉片，其中楊梅素和3-羥基黃酮僅在成熟葉片中檢測到。在黃烷酮類化合物中，3種化合物在幼嫩葉片中的表達(dá)含量顯著高于成熟葉片，3種化合物在成熟葉片中的表達(dá)含量顯著高于幼嫩葉片，其中橙皮苷僅在成熟葉片中檢測到。在黃烷醇類化合物中，1種化合物在幼嫩葉片中的表達(dá)含量顯著高于成熟葉片，6種化合物在成熟葉片中的表達(dá)含量顯著高于幼嫩葉片，其中沒食子兒茶素-兒茶素僅在幼嫩葉片中檢測到，表沒食子酸兒茶素僅在成熟葉片中檢測到。

表3 幼嫩葉片和成熟葉片之間具有顯著差異的黃酮類化合物

2.4 幼嫩與成熟葉片有機(jī)酸及其衍生物組成比較

在幼嫩葉片和成熟葉片中共檢測到16種具有顯著差異表達(dá)的有機(jī)酸及其衍生物，如表4所示。11種化合物在幼嫩葉中的表達(dá)含量顯著高于成熟葉片，5種化合物在成熟葉片中的表達(dá)含量顯著高于幼嫩葉片。其中奎寧酸O-二葡萄糖醛酸僅在成熟葉片中檢測到，苯乙醛酸僅在幼嫩葉片中檢測到。

表4 幼嫩與成熟葉片之間具有顯著差異的有機(jī)酸及其衍生物

3 討論

茶葉中含有豐富的氨基酸，其組成類別和含量都會影響茶葉的品質(zhì)［23］，此外在茶葉加工過程中氨基酸還可以轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性醛或其他產(chǎn)物，參與茶葉香氣的形成［24］。本研究在青錢柳葉片中共檢測到12種具有顯著差異表達(dá)的氨基酸，且幼嫩葉片中的表達(dá)含量均顯著高于成熟葉片，其中的苯丙氨酸、色氨酸不僅為人體必需氨基酸，還在茶葉滋味的協(xié)調(diào)中發(fā)揮著重要作用［25］141。在茶葉中發(fā)現(xiàn)并已鑒定了26種氨基酸，包括20種蛋白質(zhì)氨基酸和6種非蛋白質(zhì)氨基酸［14］。陳然等［26］分析檢測了市售8大類29種茶葉的氨基酸組分，其中包含了青錢柳葉片中12種差異顯著的氨基酸，其結(jié)果表明不同種類的茶葉具有不同的氨基酸組分及比例，青錢柳葉片中氨基酸組分及比例與市售茶葉具有相似性。茶葉在制作過程中氨基酸存在降解作用［25］146，因此采用高氨基酸含量的青錢柳幼嫩葉片所制得的茶葉可能具有更高的營養(yǎng)價(jià)值和更佳的茶湯滋味及香氣。

青錢柳葉片中的黃酮類化合物具有降血脂、降血糖、降血壓和提高免疫力的作用［27］。在日常飲食中，可以通過飲茶來攝取黃酮類化合物［28］，通過大數(shù)據(jù)調(diào)查分析，發(fā)現(xiàn)茶葉是日常飲食中黃烷-3-醇和黃酮醇的主要來源［29］。兒茶素類（黃烷醇類）、黃酮苷和黃酮醇苷不僅構(gòu)成茶湯的獨(dú)特風(fēng)味，同時(shí)也是茶湯苦澀味的重要構(gòu)成因子［30?31］。在本研究中，黃酮苷和黃酮醇苷中有5種化合物在幼嫩葉中含量顯著高于成熟葉，12種化合物在成熟葉中含量顯著高于幼嫩葉。兒茶素是茶葉保健功能的首要成分，具有抗氧化、抗癌、降血脂等作用，并且對茶葉的色、香、味品質(zhì)形成也具有重要作用［28，32］。成熟葉中共有5種兒茶素類化合物含量顯著高于幼嫩葉，1種化合物含量顯著低于幼嫩葉。盡管黃酮類化合物具有多種有益活性，但是考慮到兒茶素類、黃酮苷和黃酮醇苷類化合物都是茶葉苦澀味的主要來源之一，因此具有高兒茶素類、黃酮苷和黃酮醇苷類化合物含量的成熟葉并不適宜開發(fā)為青錢柳茶葉，而適合用做原材料提取黃酮類化合物。

有機(jī)酸類化合物是青錢柳中重要功效類物質(zhì)之一［33］，具有很強(qiáng)的抗氧化能力［34］。在本研究中，幼嫩葉中共有11種有機(jī)酸類化合物的表達(dá)含量顯著高于成熟葉片，表明其營養(yǎng)價(jià)值更高。有機(jī)酸類化合物在沖泡過程中大多數(shù)都可被浸出到茶湯中，成為影響茶湯風(fēng)味品質(zhì)的主要成分之一［35］，例如，脂肪族有機(jī)酸對滋味的貢獻(xiàn)較大，芳香族有機(jī)酸等是香氣的主要成分［34］。含有豐富有機(jī)酸類化合物含量的幼嫩葉制得的茶葉相比于成熟葉可能具有更佳的口感和香氣。

4 結(jié)語

本研究采用非靶向代謝組學(xué)方法，分析了青錢柳幼嫩葉片和成熟葉片之間的代謝物變化，共檢測到695個(gè)代謝物，其中成熟葉片相比于幼嫩葉片共有94個(gè)代謝物含量顯著上升，131個(gè)代謝物含量顯著下降。這些代謝物對制得的茶葉的色、香、味品質(zhì)形成以及營養(yǎng)價(jià)值均具有重要作用，幼嫩葉片適宜作為制作青錢柳茶的原材料，成熟葉片適宜作為工業(yè)生產(chǎn)上提取各類代謝物的原材料。