Nrf2在唾液腺多形性腺瘤及癌在多形性腺瘤中的表達及意義

劉洪偉 魏麗 林凡忠 吳德報

中圖分類號:R739.8 文獻標志碼：A doi:10.3969/j.issn.1001-3733.2021.06.022

唾液腺多形性腺瘤(salivary gland pleomorphic adenoma,SPA)是較為常見的一種唾液腺腫瘤，其發(fā)病機制尚不十分清楚，生長緩慢且后期部分容易惡變。惡變的SPA又稱為癌在多形性腺瘤(carcinoma in pleomorphic adeoma,CPA)[1]。SPA和CPA手術切除后容易復發(fā)，目前多認為是腫瘤大小、組織類型、衛(wèi)星灶、手術方式、邊緣的侵襲性及手術中的腫瘤破潰等因素相關[2-3]。因此探究多形性腺瘤的發(fā)病機理、術后復發(fā)、惡變的機制，是目前治療該疾病的重要一環(huán)。有關研究表明復發(fā)性多形性腺瘤多與腫瘤細胞的增殖活性相關，增殖活性的失控的原因目前成為焦點。核因子E2相關因子2(nuclear factor-erythroid 2-realted factor 2,Nrf2)在上皮性腫瘤細胞中的激活與抗氧化酶的誘導有關，能夠早期影響氧化應激損傷或者氧自由基的傳遞，促進腫瘤細胞的惡變[4]。從氧化應激方面研究唾液腺多形性腺瘤較少，本研究通過免疫組化方法檢查探索Nrf2在SPA和正常腮腺組織中的表達，探討它在SPA相關生物學行為的意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

納入2018 年04 月～2020 年10 月在山東省濟寧市第一人民醫(yī)院口腔頜面外科就診的SPA及癌在多形性腺瘤中手術切除病理標本50 例，瘤旁組織標本50 例，其中原發(fā)性SPA 39 例，復發(fā)性SPA 5 例，CPA 6 例。包括男性37 例，女性13 例，年齡21～77 歲，平均年齡55.32 歲。病例納入標準：(1)患者的臨床病理資料完整；(2)患者及家屬知情并簽署同意書；(3)病理均診斷為SPA及CPA。腫瘤累及腮腺38 例，頰部2 例，上腭4 例，頜下6 例，腫瘤大小約2.0～4.0 cm，惡性腫瘤均無頸部淋巴結轉移。

1.2 主要試劑及儀器

Nrf2抗體(Abcam公司，美國)；二抗檢測系統(tǒng)(MaxVision)的HRP抗兔/鼠IgG產品、PBS緩沖液、蘇木素染液、DAB顯色劑(福州邁新生物技術開發(fā)有限公司)；脫水機(ASP300S)、切片機(RM2235)(Leica公司，德國)；包埋機(EC350，MICROM公司，德國)；顯微鏡(BX51，奧林巴斯公司,日本)；顯微拍照系統(tǒng)(EOS600D，Canon公司，日本)。

1.3 免疫組織化學SP法染色

組織標本經過脫蠟水洗后，EDTA(pH 8.0)進行高溫高壓抗原修復，水洗，3%的H2O2室溫孵育10 min，以阻斷內源性過氧化酶，PBS沖洗3 次，3 min/次滴加一抗Nrf2(稀釋：1∶150)室溫孵育1 h，PBS沖洗3 次，3 min/次，滴加二抗，室溫孵育15 min，PBS沖洗3 次，3 min/次，DAB染色，蘇木素復染，脫水透明，中性樹膠封固。

1.4 免疫組織化學結果判斷

組織切片由病理科資深醫(yī)師進行雙盲法判讀，分析鏡下細胞染色及陽性細胞百分率。每張切片隨機選取5 個高倍鏡視野。根據細胞染色程度分為基本不染色為0 分，淡黃色1 分，棕黃色2 分，棕褐色3 分，褐色4 分；陽性細胞百分率：≤10%為0 分，11%～30%為1 分，31%～60%為2 分，61%～80%為3 分，>81%為4 分。染色程度和陽性百分率之和綜合評分，0～1分為陰性(-)，2～3分為弱陽性(+)，4～5分為中等陽性(++)，6～7分為強陽性(+++)，其中(-)和(+)為低表達組，(++)和(+++)為高表達組[5]。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPASS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，所有計數資料以[例(%)]表示，組間比較均采用χ2檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 Nrf2蛋白在唾液腺SPA及CPA中的表達

實驗發(fā)現Nrf2在SPA、CPA及腺旁正常組織中均有表達(圖1)，Nrf2陽性表達主要位于細胞質和細胞膜，鏡下為棕黃色顆粒。Nrf2在涎腺腫瘤周圍正常組織陰性37 例(74.00%，37/50)，弱陽性13 例(26.00%，13/50)。Nrf2在腫瘤表達弱陽性22 例(44.00%，22/50)，強陽性28(56.00%，28/50)。經χ2檢驗Nrf2蛋白表達與腫瘤發(fā)生有顯著統(tǒng)計學意義(表1)。

表1 Nrf2在SPA及CPA中的表達結果Tab 1 The expression of Nrf2 in SPA and CPA

圖1 Nrf2在SPA和CPA中的表達(×200)

2.2 Nrf2蛋白表達與腫瘤病理特征的相關性

多形性腺瘤不同的病理特征表現為腫瘤包膜的完整性、腫瘤未侵犯包膜、腫瘤包膜不完整、腫瘤侵及包膜及衛(wèi)星灶、癌在腫瘤中等。Nrf2在腫瘤細胞中不同的病理類型的表達：腫瘤不侵犯包膜且包膜完整(+)10 例，(++)3 例；腫瘤包膜不完整(++)6 例，(+)9 例；腫瘤侵及包膜及有衛(wèi)星灶(++)13 例，(+)3 例，癌在多形性腺瘤(++)6 例。Nrf2在不同的腫瘤病理特征中，陽性表達率有所不同，顯示腫瘤侵犯包膜、衛(wèi)星灶及惡變呈正相關(表2)。

表2 SPA及CPA中Nrf2表達與病理特征的相關性Tab 2 Correlation between the expression of Nrf2 and the pathological features of SPA and CPA

2.3 Nrf2蛋白表達與原發(fā)性和復發(fā)性多形性腺瘤的相關性

原發(fā)性唾液腺多形性腺瘤中陽性表達率46.15%(18/39),復發(fā)性多形性腺瘤陽性表達率80%(4/5), 癌在多形性腺瘤陽性表達率100%(6/6)(表3)。

表3 Nrf2在原發(fā)性、復發(fā)性SPA及CPA的表達結果Tab 3 The expression of Nrf2 in primary, recurrent SPA and CPA

3 討 論

多形性腺瘤是唾液腺腫瘤中最常見的疾病之一，其特點生長緩慢，易復發(fā)，加速生長易惡變，部分具有侵襲性。因此研究者們進行了許多實驗和研究，積極尋找多形性腺瘤發(fā)病機制及良惡性腫瘤轉化原因，為制定腫瘤治療提供依據。近些年來，有大量文獻報告Nrf2基因與腫瘤之間的關系，表明其與肺癌、甲狀腺癌、肝癌、乳腺癌等的相關性[6-8], Nrf2是協(xié)同刺激分子B7家族成員，具有獨特的生物學功能，對腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有促進腫瘤和抑制腫瘤作用兩面性，通過Nrf2-Keap1/ARE系統(tǒng)通路參與氧化應激反應，抵御外來因素誘發(fā)的氧化損害。Nrf2不僅具有維持機體氧化還原平衡抑制腫瘤的發(fā)生，還具有過度表達促進腫瘤細胞異常增殖能力，腫瘤細胞內Nrf2持續(xù)激活抑制細胞凋亡，從而促進腫瘤細胞的發(fā)生與惡化。吳智華等[9]舌鱗狀細胞癌相關研究中發(fā)現Nrf2高表達說明其在發(fā)生發(fā)展及預后過程中起到重要作用。腫瘤的發(fā)生發(fā)展與氧化應激反應密切相關，有關研究[10-12]發(fā)現，活性氧是氧化應激的重要產物，NF-kB是氧化還原調節(jié)的氧化感受器，在多數腫瘤患者中檢測到活性氧的升高，激活NF-kB途徑同時也促進了細胞的增殖的調節(jié)失控，表現為腫瘤細胞無限增殖、自主分裂和腫瘤的形成。Nrf2是氧化應激反應過程中重要的效應分子，能夠對外源性損傷因素進行Nrf2-Keap1系統(tǒng)活化[13-14]，抵制外來因素誘發(fā)的氧化損害、維持機體細胞內氧化還原平衡等方面發(fā)揮重要作用。

多形性腺瘤是涎腺中最常見的涎腺上皮腫瘤，具有病程長、多次復發(fā)、易惡變等特點，近些年研究者多從細胞遺傳學、抑癌基因、基質蛋白等方面進行研究[15-17]，大多數學者[18-19]認為多形性腺瘤的復發(fā)和惡變同腫瘤所含上皮細胞和基質細胞數量密切相關，上皮細胞豐富則腫瘤容易惡變，而基質細胞豐富更易于復發(fā)。劉芳等[20]的研究發(fā)現NF-kB可能與多形性腺瘤的復發(fā)和惡變有關。近期有關研究[21]發(fā)現Nrf2在大鼠腮腺條紋狀小葉間管細胞和周圍腺胞細胞表達，而在多形性腺癌中表現出現高表達，并且同轉移與Nrf2的過表達有顯著的相關性[22]。本研究發(fā)現Nrf2在腺體組織及腫瘤腺多在細胞膜和細胞質表達，正常腺體組織內表達弱陽性表達占到26%，無強陽性表達。多形性腺瘤及癌在多形性腺瘤中Nrf2均出現表達，強弱不等，表達的強弱均同腫瘤的病理學特征及腫瘤細胞的類型相關。腫瘤包膜不完整、出現衛(wèi)星灶、侵犯包膜及腫瘤惡變等均出現強陽性，同時發(fā)現細胞豐富型多形性腺瘤陽性率較基質豐富性多形性腺瘤高。本實驗研究表明癌在多形性腺瘤Nrf2陽性表達率均高于復發(fā)性和原發(fā)性多形性腺瘤，因此可以推測Nrf2陽性表達率高的的多形性腺瘤更容易發(fā)生惡變、復發(fā)。

本研究結果發(fā)現，良惡性多形性腺瘤的發(fā)生、發(fā)展與氧化應激可能密切相關，Nrf2表達水平是非常重要的預測因子，Nrf2-Keap1系統(tǒng)通路可能參與了腫瘤的演變，Keap1的作用還需要進一步擴大樣本進行研究，并通過基因檢測明確具體機制。