劉志聰 鄭丹萍
摘要 [目的]優(yōu)化微波輔助提取潮州柑橘皮中總黃酮的工藝。[方法]采取微波輔助提取法,以乙醇濃度、料液比、微波功率和微波時(shí)間為因素,利用4因素3個(gè)水平正交試驗(yàn),以總黃酮提取率作為評(píng)價(jià)指標(biāo),篩選最佳提取工藝。[結(jié)果]影響潮州柑橘皮中黃酮提取率的因素依次為微波功率、微波時(shí)間、料液比和乙醇濃度,最佳提取工藝條件為45%乙醇濃度,料液比1∶30(g∶mL),微波時(shí)間60 s,微波功率640 W,在該工藝條件下柑橘皮中總黃酮提取率可達(dá)1.173%。[結(jié)論]該研究可為潮州柑橘皮黃酮類(lèi)化合物的開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。
關(guān)鍵詞 潮州柑橘皮;微波輔助提取;總黃酮;正交試驗(yàn)
中圖分類(lèi)號(hào) TS 209? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611(2021)23-0188-04
doi:10.3969/j.issn.0517-6611.2021.23.053
Study on Microwave-assisted Extration of Total Flavonoids from Chaozhou Citrus Peel
LIU Zhi-cong, ZHENG Dan-ping
(School of Life Sciences and Food Engineering, Hanshan Normoal Universiy,Chaozhou, Guangdong 521000)
Abstract [Objective]To optimize the microwave-assisted extraction of flavonoids from Chaozhou citrus peel. [Method]Microwave assisted extraction was used to screen the best extraction process by taking ethanol concentration, solid-liquid ratio, microwave power and microwave time as factors, using 4 factors and 3 levels orthogonal test, and taking the extraction rate of total flavonoids as the evaluation index. [Result]The main factors affecting the extraction rate of flavonoids from Chaozhou citrus peel were microwave power, microwave time, solid-liquid ratio and ethanol concentration. The optimum extraction conditions were 45% ethanol concentration, solid-liquid ratio 1∶30 (g∶mL), microwave time 60 s and microwave 640 W. Under these conditions, the extraction rate of flavonoids from citrus peel could reach 1.173%. [Conclusion]This study can provide a scientific basis for the development and utilization of flavonoids in Chaozhou citrus peel.
Key words Chaozhou citrus peel;Microwave-assisted extraction;Total flavonoids;Orthogonal test
基金項(xiàng)目 廣東省粵東藥食資源功能物質(zhì)與治未病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(2021B1212040015)。
作者簡(jiǎn)介 劉志聰(1983—),男,廣東興寧人,實(shí)驗(yàn)師,碩士,從事天然活性產(chǎn)物研究。
收稿日期 2021-03-17;修回日期 2021-04-27
柑橘皮醫(yī)學(xué)上稱為陳皮,為蕓香科植物柑橘成熟果實(shí)的果皮,在我國(guó)有悠久的藥用歷史。我國(guó)古代醫(yī)學(xué)認(rèn)為,柑橘皮性味辛、微溫、無(wú)毒、入脾、肺經(jīng),有理氣調(diào)中、燥濕消痰、行氣導(dǎo)滯的功效,具有消炎、抗?jié)?、抑菌及利膽等作用[1]。柑橘皮所含營(yíng)養(yǎng)成分除氨基酸外,其余成分含量均高于果肉,特別是果皮中富含橙皮苷、新橙皮苷、橘皮素、川陳皮素、二晴川陳皮等黃酮類(lèi)化合物[2]。黃酮類(lèi)化合物(Flavonoids)在植物中廣泛存在,是植物經(jīng)光合作用產(chǎn)生的一大類(lèi)次生代謝產(chǎn)物,作為一種功能成分,具有抗腫瘤、延緩衰老、增強(qiáng)心血管功能、增強(qiáng)免疫力、調(diào)解內(nèi)分泌系統(tǒng)、護(hù)肝、抗炎、抗過(guò)敏、抑菌、抗病毒等功效[3]。近年來(lái),國(guó)內(nèi)外對(duì)黃酮類(lèi)化合物的提取工藝優(yōu)化及功能活性分析進(jìn)行了大量研究[4-14]。柑橘皮中同樣含有多種黃酮類(lèi)化合物,對(duì)柑橘皮藥理作用的廣泛深入研究和臨床試驗(yàn)[2,15-16]證實(shí),黃酮類(lèi)化合物起著非常重要的作用。
潮州柑在潮汕地區(qū)栽培歷史悠久,至今已有1 300余年的歷史,是潮汕地區(qū)著名水果品種之一,也是潮汕地區(qū)老百姓比較喜愛(ài)的水果之一,每年會(huì)產(chǎn)生大量的果皮資源待利用。近年來(lái),從柑橘皮中提取香精油、果膠和類(lèi)胡蘿卜素等,已取得一定的研究成果,但尚未形成規(guī)模化生產(chǎn)。目前,柑橘皮除少量用于中藥和食品加工外,大部分柑橘皮被作為垃圾丟棄[15]。微波輔助提取技術(shù)具有耗能低、效率高、不破壞有效成分等優(yōu)點(diǎn)。該研究通過(guò)優(yōu)化微波輔助提取潮州柑橘皮中黃酮的工藝,為潮州柑橘皮中黃酮類(lèi)化合物的開(kāi)發(fā)利用提供理論參考。
1 材料與方法
1.1 供試材料
市售新鮮的潮州柑橘洗凈取皮,在烘箱中(50 ℃)鼓風(fēng)干燥,將干燥后的柑橘皮經(jīng)粉碎機(jī)粉碎,過(guò)60目,備用。
1.2 主要試劑
蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)生物制品檢定所),95%乙醇、水、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁,均為國(guó)產(chǎn)分析純。
1.3 主要儀器
電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠),手提式粉碎機(jī),JA3003N電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司),WD800G型微波爐(格蘭仕微波爐電器有限公司),800型離心機(jī)(上海手術(shù)器械廠),WFJ7200型可見(jiàn)分光光度計(jì)(尤尼柯(上海)儀器有限公司)。
1.4 試驗(yàn)方法
1.4.1 微波輔助提取柑橘皮總黃酮工藝流程(圖1)。
1.4.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[16]。
精密稱取經(jīng)105 ℃干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)試劑0.011 g,用60%(V/V)乙醇溶解,并定量轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶,用60%乙醇定容,搖勻配置成濃度為0.11 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)母液。準(zhǔn)確吸取0.11 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)母液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于5只25 mL容量瓶中,加入15 mL 60%乙醇。然后加入0.3 mL 5%NaNO2,搖勻靜置6 min,再加入0.3 mL 10% Al(NO)3,搖勻靜置6 min后加入2.0 mL 1 mol/L NaOH,用60%乙醇定容至刻度線,搖勻靜置12 min。以60%乙醇作為空白對(duì)照,在500 nm處測(cè)定其吸光度3次,取平均值。以蘆丁濃度(C)為橫坐標(biāo),吸光度(A)為縱坐標(biāo),繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2),建立回歸方程:y=11.071 0x+0.000 7,相關(guān)系數(shù)R2=0.999 7,具有較好的線性。
1.4.3 樣品中黃酮含量的測(cè)定。
取樣品溶液1.0 mL于25 mL容量瓶中,加入15 mL 60%乙醇,分別加入0.3 mL 5%NaNO2,搖勻靜置6 min,加入0.3 mL 10% Al(NO)3,搖勻靜置6 min后加入2.0 mL 1 mol/L NaOH,最后用60%乙醇定容至刻度,搖勻靜置12 min。以60%乙醇作為空白對(duì)照,在500 nm處測(cè)定吸光度,平行試驗(yàn)3次,吸光度取平均值,根據(jù)回歸方程計(jì)算樣品溶液的濃度及總黃酮含量。
總黃酮含量=C×F×V/m×100%
式中,C為樣品中黃酮濃度,mg/mL;F為溶液稀釋倍數(shù);V為溶液體積,mL;m為樣品質(zhì)量,mg。
1.4.4 微波提取工藝優(yōu)化。
1.4.4.1 單因素試驗(yàn)。
根據(jù)預(yù)試驗(yàn)可知,影響柑橘皮總黃酮含量提取的因素為乙醇濃度、料液比、微波功率及微波時(shí)間,為獲得最高的提取率,進(jìn)行以下單因素試驗(yàn):
(1)乙醇濃度:準(zhǔn)確稱取1 g柑橘皮粉末,在料液比1∶10,微波功率320 W,微波時(shí)間40 s的條件下,分別設(shè)置體積分?jǐn)?shù)為35%、45%、55%、65%、75%的乙醇進(jìn)行試驗(yàn)。
(2)料液比:準(zhǔn)確稱取1 g柑橘皮粉末,在體積分?jǐn)?shù)為55%乙醇,微波功率320 W,微波時(shí)間40 s的條件下,分別選擇料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50進(jìn)行試驗(yàn)。
(3)微波功率:準(zhǔn)確稱取1 g柑橘皮粉末,在體積分?jǐn)?shù)為55%乙醇,料液比1∶20,微波時(shí)間40 s的條件下,分別設(shè)定微波功率為0、160、320、480、640 W進(jìn)行試驗(yàn)。
(4)微波時(shí)間:準(zhǔn)確稱取1 g柑橘皮粉末,在體積分?jǐn)?shù)為55%乙醇,料液比1∶20,微波功率480 W的條件下,分別設(shè)定微波時(shí)間為20、30、40、50、60 s進(jìn)行試驗(yàn)。
1.4.4.2 正交試驗(yàn)。
根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,以乙醇濃度、料液比、微波時(shí)間、微波功率設(shè)計(jì)4因素3水平(L9(34))正交試驗(yàn)(表1)。
2 結(jié)果與分析
2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果
2.1.1 乙醇濃度對(duì)柑橘皮中總黃酮提取率的影響。
由圖3可知,隨著乙醇濃度的升高,柑橘皮總黃酮的提取率也隨之增大,在乙醇濃度在55%時(shí)可達(dá)到最大值,繼續(xù)升高乙醇濃度,柑橘皮總黃酮提取率反而下降。這可能與微波加熱的機(jī)理有關(guān),因?yàn)樘岣咭掖紳舛瓤梢栽龃筇崛?duì)樣品的滲透性,也可提高黃酮類(lèi)化合物的溶解度,從而提高柑橘皮總黃酮的提取率,而在使用微波加熱時(shí),樣品中的極性分子尤其是水分子吸收微波能會(huì)產(chǎn)生大量熱量使樣品升溫,乙醇濃度增大的同時(shí)就減小了料液中水的比例,使樣品升溫減慢從而影響柑橘皮黃酮的提取率。此外,柑橘皮中的黃酮類(lèi)化合物含有易溶于水的黃酮苷和易溶于有機(jī)溶劑的黃酮苷元,且黃酮苷的含量高于黃酮苷元。當(dāng)乙醇濃度低時(shí),隨著乙醇濃度的升高,黃酮苷元溶解增加,黃酮的提取率逐步增大,但當(dāng)乙醇濃度超過(guò)55%,隨著乙醇濃度升高,易溶于水的黃酮苷溶解減少,導(dǎo)致總黃酮的提取率下降。因此,乙醇的最佳濃度初步定為55%。
2.1.2 料液比對(duì)柑橘皮中總黃酮提取率的影響。
由圖4可知,隨著料液比的增大,柑橘皮總黃酮的提取率逐步提高,當(dāng)料液比達(dá)到1∶20時(shí),總黃酮的提取率最大,繼續(xù)增加溶劑量,提取率反而下降。究其原因可能是在料液比小于1∶20時(shí),溶劑量過(guò)少導(dǎo)致柑橘皮中黃酮類(lèi)化合物不能完全被提取;但料液比達(dá)到1∶20時(shí),柑橘皮中黃酮類(lèi)化合物被完全提取,因此黃酮提取率此時(shí)為最高;繼續(xù)增大料液比,由于溶劑量過(guò)多而使黃酮類(lèi)化合物提取率下降。這可能由于當(dāng)料液比大于1∶20時(shí),提取劑對(duì)微波能的吸收增加,溫度升高減慢,導(dǎo)致細(xì)胞液對(duì)微波能吸收減少,細(xì)胞破裂不完全,柑橘皮中黃酮類(lèi)化合物難以充分溶出。因此,提取的最佳料液比初步定為1∶20。
2.1.3 微波功率對(duì)柑橘皮中總黃酮提取率的影響。
由圖5可知,柑橘皮總黃酮的提取率隨微波功率的增大而提高,在320~480 W時(shí)提高尤為明顯;當(dāng)微波功率大于480 W時(shí),柑橘皮總黃酮提取率反而下降。這可能是由于微波輻射使細(xì)胞內(nèi)部溫度升高,壓力增大,細(xì)胞壁破裂,化合物從細(xì)胞中釋放出來(lái)。一定時(shí)間范圍內(nèi),輻射功率越高細(xì)胞破碎越完全,柑橘皮中總黃酮的提取率越高;但微波功率過(guò)高,會(huì)導(dǎo)致黃酮類(lèi)化合物的活性成分被破壞,發(fā)生變性或者降解,從而導(dǎo)致柑橘皮中總黃酮的提取率降低。因此,提取的最佳微波功率初步定為480 W。
2.1.4 微波時(shí)間對(duì)柑橘皮中總黃酮提取率的影響。
由圖6可知,當(dāng)微波提取時(shí)間為20~50 s,柑橘皮總黃酮的提取率隨著微波時(shí)間的延長(zhǎng)而迅速提高,但持續(xù)延長(zhǎng)微波提取時(shí)間,總黃酮提取率反而下降。這很大程度是由于柑橘皮中黃酮類(lèi)物質(zhì)的溶出需要一定時(shí)間,當(dāng)時(shí)間小于50 s時(shí),由于時(shí)間短,細(xì)胞壁尚未完全破裂,總黃酮的提取率隨時(shí)間的增加而提高,而當(dāng)時(shí)間大于50 s,總黃酮部分被分解或變性,有效成分減少,同時(shí)長(zhǎng)時(shí)間的微波會(huì)導(dǎo)致乙醇揮發(fā)速度加快,從而使總黃酮的提取率降低。因此,提取的最佳微波時(shí)間初步確定為50 s。
2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果
根據(jù)上述單因素試驗(yàn)結(jié)果,選擇乙醇濃度(45%、55%、65%)、料液比(1∶10、1∶20、1∶30)、微波功率(320、480、640 W)、微波時(shí)間(40、50、60 s)4個(gè)因素作為變量進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)(表1)。以柑橘皮中總黃酮的提取率為考察指標(biāo),進(jìn)一步優(yōu)化柑橘皮中黃酮類(lèi)化合物的提取條件。用SPSS 11.5軟件進(jìn)行正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析,結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知,在4個(gè)影響因素中,對(duì)柑橘皮中黃酮類(lèi)化合物提取率的影響從大到小依次為微波功率、微波時(shí)間、料液比、乙醇濃度。
采用正交助手軟件對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析,并對(duì)影響因素繪制了效應(yīng)曲線,結(jié)果見(jiàn)表3、圖7。
由表3的方差分析結(jié)果表明,微波功率對(duì)柑橘皮總黃酮提取的影響達(dá)到顯著水平,而乙醇濃度、料液比、微波時(shí)間均對(duì)柑橘皮總黃酮提取無(wú)顯著影響。
由圖7的效應(yīng)曲線可以看出,乙醇濃度、料液比、微波功率、微波時(shí)間4個(gè)因素對(duì)柑橘皮總黃酮提取率的影響效果變化趨勢(shì)不同,但都出現(xiàn)明顯的拐點(diǎn)。
綜上所述,由表2可知,以總黃酮提取率為指標(biāo),正交試驗(yàn)的最佳組合為A1B3C3D3,即乙醇濃度為45%,料液比為1∶30,微波功率為640 W,微波時(shí)間為60 s。
2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)
在正交試驗(yàn)最佳組合提取工藝條件下進(jìn)行5次平行驗(yàn)證試驗(yàn),準(zhǔn)確稱取1 g柑橘皮粉末,以45%乙醇,料液比1∶30,微波功率640 W,微波時(shí)間60 s進(jìn)行微波提取,測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知,在最佳組合工藝提取條件下,5次驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果接近,潮州柑橘皮總黃酮的平均提取率為1.173%,相對(duì)平均偏差為0.382%,說(shuō)明微波輔助法提取潮州柑橘皮中黃酮的優(yōu)化工藝穩(wěn)定可靠。
3 結(jié)論
該研究通過(guò)單因素試驗(yàn)分別考察了乙醇濃度、料液比、微波功率和微波時(shí)間對(duì)潮州柑橘皮中總黃酮提取效果的影響,并通過(guò)正交試驗(yàn)(L9(34)),以總黃酮提取率為考察指標(biāo),優(yōu)化潮州柑橘皮中總黃酮的最佳提取工藝條件,即乙醇濃度為45%,料液比為1∶30,微波功率為640 W,微波時(shí)間為60 s,在該工藝條件下潮州柑橘皮中黃酮平均提取率為1.173%。
通過(guò)數(shù)據(jù)軟件分得出考4種因素的影響從大到小為微波功率、微波時(shí)間、料液比、乙醇濃度,即最重要的影響因素為微波功率,其次為微波時(shí)間,說(shuō)明微波對(duì)潮州柑橘皮中黃酮類(lèi)化合物的提取有較為明顯的促進(jìn)作用。通過(guò)試驗(yàn)表明,潮州柑橘皮中含有豐富的黃酮類(lèi)化合物,能為今后潮州柑橘皮中黃酮的開(kāi)發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。
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