尺寸排阻-反相液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在大鼠腎臟翻譯后修飾蛋白質(zhì)鑒定中的應(yīng)用

李健民, 卓 越, 張毅達, 李 娜, 伍建林

(澳門科技大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院, 中藥質(zhì)量研究國家重點實驗室, 澳門 999078)

蛋白質(zhì)組學(xué)研究近年來引起了越來越多的關(guān)注,并且處于技術(shù)發(fā)展階段[1]。蛋白質(zhì)組學(xué)的主要挑戰(zhàn)是鑒定高度復(fù)雜、寬動態(tài)范圍樣品中的低豐度蛋白質(zhì),由于樣品的復(fù)雜性和廣泛的動態(tài)范圍,執(zhí)行無差別的蛋白質(zhì)組分析是一項非凡的挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的一維液相色譜(1D-LC)通常無法為復(fù)雜樣品的分析提供足夠的分離能力[2,3],這激發(fā)了不同液相色譜技術(shù)(例如二維液相色譜,2D-LC)[4]組合的發(fā)展。在2D-LC中,收集來自第一維液相色譜(第一液相色譜)的流分,然后將其重新注入第二維液相色譜(第二液相色譜)[5,6],兩種不同的分離方法相結(jié)合可以獲得更高的分離效率[7]。如2D強陽離子交換-反相液相色譜法(2D SCX-RPLC),由于SCX色譜柱上的靜電相互作用和C18色譜柱上的疏水相互作用相結(jié)合,具有較高的檢測靈敏度和出色的分離性能,廣泛應(yīng)用于自下而上的鳥槍法蛋白質(zhì)組學(xué)當中[8,9]。

尺寸排阻色譜法(SEC)是一種廣泛用于蛋白質(zhì)分離純化的傳統(tǒng)技術(shù),該技術(shù)主要用于制備純化和脫鹽,尤其是在分子生物學(xué)中,該技術(shù)被大量用于生產(chǎn)純凈蛋白質(zhì)[10-13]。反相液相色譜(RPLC)由于其多功能性、靈活性和耐用性,是分析多肽及蛋白質(zhì)的主要方法之一[14]。肽段進入反相色譜柱后,利用肽段的疏水性,根據(jù)不同分配系數(shù)依次流出,實現(xiàn)肽段分離。利用SEC對蛋白質(zhì)進行分離純化,不僅可以降低樣品復(fù)雜度,并且可以對復(fù)雜蛋白質(zhì)樣品中的低豐度蛋白質(zhì)進行富集,再結(jié)合RPLC進行肽段分離實現(xiàn)肽段分析。

蛋白質(zhì)的翻譯后修飾(PTM)是具有許多生物學(xué)功能的細胞蛋白質(zhì)的重要調(diào)控機制之一。蛋白質(zhì)的翻譯后修飾廣泛存在于各種細胞器的蛋白質(zhì)中,并且在不同種類細胞器中具有不同的生物功能[15]。隨著質(zhì)譜技術(shù)的廣泛應(yīng)用,這些化學(xué)修飾在蛋白質(zhì)質(zhì)量上的變化能被精確地檢測到,并且能進行大規(guī)模、全面的PTM篩選,以實現(xiàn)對蛋白質(zhì)生理研究以及疾病預(yù)防治療更深入的了解。迄今為止,已鑒定出超過450種獨特的蛋白質(zhì)修飾,包括磷酸化、乙酰化、氨基甲?；⒀趸?它們可以通過翻譯后修飾改變目標蛋白質(zhì)的活性、分布、相互作用及壽命[16]。每個細胞當中具有翻譯后修飾的蛋白質(zhì)總量約占單個細胞總蛋白質(zhì)的1%[17-20],且蛋白質(zhì)濃度的差異甚至可以達到數(shù)百萬至數(shù)十億倍,所以鑒定低濃度蛋白質(zhì)及該類蛋白質(zhì)的翻譯后修飾需要更靈敏、準確的分離及檢測方法。腎臟作為重要的排泄器官,它的基本功能是生成尿液,借以清除體內(nèi)代謝產(chǎn)物及某些廢物、毒物,同時經(jīng)重吸收功能保留水分及其他有用物質(zhì),而PTM參與腎臟中各種細胞過程和信號傳導(dǎo)途徑[21-27]。最近的研究表明腎臟縫隙隔膜、足細胞、神經(jīng)節(jié)和足突的局部粘著可能存在蛋白質(zhì)修飾[22-26,28]。這些腎臟中的蛋白質(zhì)修飾,不僅在腎小球超濾功能中,而且在腎穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)過程中也起著關(guān)鍵作用。而磷酸化修飾作為最普遍的PTM,幾乎與每個細胞過程密切相關(guān)[29],它在調(diào)節(jié)多種代謝酶的活性中起關(guān)鍵作用[30],如協(xié)調(diào)激活A(yù)TP合酶為細胞提供能量維持細胞正常運作等[31]。

為了鑒定更多的大鼠腎臟蛋白質(zhì)以及翻譯后修飾的蛋白質(zhì),我們構(gòu)建了SEC-RPLC-MS系統(tǒng),采用SEC對腎臟蛋白質(zhì)樣品進行預(yù)分離,降低樣品蛋白質(zhì)復(fù)雜度,并使用nano-RPLC-MS對預(yù)分離蛋白質(zhì)的胰蛋白酶解肽進行分離和鑒定。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

醋酸銨、磷酸化鹽、乙腈(均來自美國Sigma-Aldrich公司);二硫蘇糖醇(DTT),碘乙酰胺(IAA)和尿素(來自美國GE Healthcare公司)。胰蛋白酶(質(zhì)譜純)(來自美國Thermo Fisher Scientific)。Dionex Ultimate 3000 RSLC UPLC & Bruker maXis Impact Q-TOF-MS串聯(lián)質(zhì)譜;ST-16R型高速冷凍離心機(美國Thermo公司);水由Milli-Q Ultrapure水系統(tǒng)(美國Millipore公司)生產(chǎn)。

1.2 樣品制備

實驗大鼠是購自香港中文大學(xué)的Sprague-Dawley (SD)大鼠,并在澳門科技大學(xué)的動物房中繁殖。選用8周齡的雄性SD大鼠(225 g),麻醉后生理鹽水腹腔主靜脈灌注洗凈血液,取出腎臟用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗凈。橫向切取右腎組織100 mg,加入1 mL PBS勻漿,離心后取上清液。300 μL上清液加入1 200 μL冷丙酮沉淀,6 000 r/min下離心5 min,取蛋白質(zhì)沉淀。蛋白質(zhì)沉淀加入300 μL PBS復(fù)溶,12 000 r/min下離心10 min后取290 μL上清液待用。

1.3 腎臟蛋白質(zhì)SEC預(yù)分離

收集腎蛋白質(zhì)上清液采用BCA(bicinchoninic acid)方法測定蛋白質(zhì)濃度后,使用Agilent 1100 system制備液相系統(tǒng)將290 μL (827.5 μg)腎蛋白質(zhì)溶液進行SEC預(yù)分離。對于SEC,使用Phenomenex(美國Torrance公司)的BioSep-SEC-3000色譜柱(300 mm×7.8 mm)、Cartridges GFC 3000保護柱(3.0 mm×4 mm)。流動相為30 mmol/L醋酸銨(pH值調(diào)至7),流速為1 mL/min,在280 nm處進行吸光度檢測,依次收集蛋白質(zhì)流分?；厥盏牡鞍踪|(zhì)流分使用Millipore超濾離心管(3 K, 15 mL)在4 000 g下離心濃縮45 min,轉(zhuǎn)移濃縮液至離心管內(nèi)。冷凍后,使用冷凍離心干燥機除去剩余的液體,收集蛋白質(zhì)粉末。

1.4 蛋白質(zhì)酶解

收集的預(yù)分離腎臟蛋白質(zhì)粉末加入100 μL 8 mol/L尿素進行復(fù)溶,12 000 r/min下離心5 min后取上清液,使用BCA方法測定蛋白質(zhì)濃度。取總蛋白質(zhì)質(zhì)量為100 μg的上清,在室溫下用DTT(200 mmol/L)還原60 min。加入IAA(1 mol/L),轉(zhuǎn)移至黑暗中孵育60 min。反應(yīng)混合物在室溫下用DTT(200 mmol/L)淬滅60 min。加入25 mmol/L的碳酸銨溶液,直到尿素濃度低于1 mol/L。最后,加入2 μg胰蛋白酶,在37 ℃烘箱消化過夜。用SPE C18柱實現(xiàn)消化液除鹽,洗脫液在氮氣下干燥。

1.5 nano-RPLC-Q-TOF-MS

用50 μL 2%乙腈(含0.1%三氟乙酸, v/v)溶解胰蛋白酶解肽,12 000 r/min下離心10 min后取上清液進樣。使用Ultimate 3000 RSLC UPLC(Dionex)與maXis Impact Q-TOF-MS(Bruker)串聯(lián)系統(tǒng)實現(xiàn)肽段分離和鑒定,正離子模式使用Bruker Advance CaptiveSpray離子源。上清液上樣到Acclaim PepMap 100 nanoViper C18捕獲柱(2 cm×75 μm, 3 μm, Thermo)。然后在Acclaim PepMap RSLC nanoViper C18分析柱(15 cm×75 μm, 2 μm, Thermo)上以300 nL/min的流速分離肽段。流動相由(A)水中含0.1%甲酸(FA)和(B)乙腈中含0.1%FA組成,梯度如下:0～8.0 min, 5%B; 8.0～110.0 min, B從5%線性增加到40%; 110.0～110.1 min, B從40%線性增加到80%; 110.1～115.0 min, 80%B; 115.0～115.1 min,恢復(fù)至5%B; 115.1～120.0 min, 5%B。進樣量為1 μL。質(zhì)譜用正離子模式下的Bruker Advance CaptiveSpray離子源。干燥氣的溫度為160 ℃,流速為4.0 L/min。端板偏移和毛細管電壓分別設(shè)置為500 V和1 400 V。在m/z330和1 400之間的范圍內(nèi)選擇了前10個前體離子,并且排除了帶單電荷的離子,而MS/MS分析首選帶電狀態(tài)為+2、+3和+4的前體離子。

1.6 蛋白質(zhì)鑒定

使用Data Analysis軟件處理MS數(shù)據(jù)導(dǎo)出的. mgf文件,將該. mgf數(shù)據(jù)導(dǎo)入MASCOT搜索引擎中,數(shù)據(jù)庫為Swiss-Prot 51.6。選擇胰蛋白酶作為酶;固定修飾為carbamidomethyl (C),可變修飾為Phospho-S、Phospho-T、Phospho-Y、Acetyl-K、Carbamyl-K、Methyl-DE、Oxidation-M等7個修飾;前體離子和MS/MS允許誤差范圍分別設(shè)定為30×10-6(30 ppm)和0.2 Da;肽電荷為2+、3+和4+。

2 結(jié)果與討論

我們了構(gòu)建SEC-RPLC系統(tǒng),采用SEC對腎臟蛋白質(zhì)樣品進行預(yù)分離,降低樣品蛋白質(zhì)復(fù)雜度,從而提高低豐度蛋白質(zhì)的檢測靈敏度。

2.1 SEC流動相優(yōu)化及流分濃縮

2.1.1SEC流動相優(yōu)化

為提高尺寸排阻色譜對蛋白質(zhì)的分離能力,首先對流動相進行了優(yōu)化。20 μL腎臟蛋白質(zhì)溶液(2.85 μg/μL)進樣,分別使用30 mmol/L醋酸銨、10 mmol/L PBS或Milli-Q水作為流動相進行分離,檢測波長為280 nm。在尺寸排阻色譜柱中,蛋白質(zhì)是根據(jù)其在流動相中流體動力學(xué)體積的差異,通過擴散進出停滯的孔而分離出來的。具有中等離子強度的非變性水性緩沖液(如醋酸銨、磷酸緩沖鹽溶液等),通常用于最大程度減少蛋白質(zhì)與固定相表面的非特異性相互作用[32,33]。PBS因能有效提高蛋白質(zhì)在SEC的分離效率而被廣泛應(yīng)用[34],但缺點是非揮發(fā)性鹽的殘留在后續(xù)的質(zhì)譜檢測時會導(dǎo)致質(zhì)譜損傷;醋酸銨作為揮發(fā)性鹽被廣泛應(yīng)用到LC-MS串聯(lián)質(zhì)譜上,可在提高SEC蛋白質(zhì)分離效率的同時保證蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及活性[35],且作為揮發(fā)性鹽可避免對儀器的損傷。我們的結(jié)果表明,使用醋酸銨的液相色譜圖可顯示更多的單獨色譜峰,峰形更完整,具有更高的分離效率(見圖1a),故采用質(zhì)譜兼容的醋酸銨作為流動相鹽。

圖 1 尺寸排阻色譜流動相的優(yōu)化Fig. 1 Optimization of size exclusion chromatography (SEC) mobile phase a. buffers; b. concentrations of buffer. HAc: ammonium acetate; PBS: phosphate buffer solution.

接下來,對流動相的鹽濃度進行了優(yōu)化,醋酸銨濃度分別為10、30和50 mmol/L。結(jié)果顯示30 mmol/L醋酸銨分離效率高于10 mmol/L醋酸銨,提示適當提高鹽濃度可減少蛋白質(zhì)表面的電荷數(shù)量,減少蛋白質(zhì)與填料表面可能的吸附[36]。50 mmol/L的分離效果卻低于30 mmol/L醋酸銨的分離效果(見圖1b)。雖然緩沖鹽能抑制蛋白質(zhì)與填料之間的靜電效應(yīng),但提高鹽濃度也會增強蛋白質(zhì)與色譜柱填料的疏水相互作用(通常在高鹽濃度下占主導(dǎo)地位),影響蛋白質(zhì)分離效果[36,37]。為了最佳的分離效率,及減少鹽濃度便于后續(xù)實驗處理,采用30 mmol/L醋酸銨作為流動相。

2.1.2蛋白質(zhì)流分的濃縮

在SEC分離腎臟蛋白質(zhì)前及濃縮富集后,分別測定蛋白質(zhì)的量并計算回收率。常規(guī)的流分濃縮方法是收集流分后進行冷凍干燥,回收率僅為75.74%,其可能由于樣品較大的體積,在處理過程中與容器壁接觸面積較大導(dǎo)致樣品損失嚴重;并且該方法所需時間過長,每次冷凍干燥需要20 h以上。為了降低蛋白質(zhì)損失及減少所需時間,先使用超濾離心管(3 K)對樣品進行濃縮,將濃縮的蛋白質(zhì)溶液進行冷凍干燥,可將濃縮時間降至6～7 h。使用超濾離心管-冷凍干燥方法的蛋白質(zhì)回收率可以達到89.67%,高于僅使用冷凍干燥濃縮的方法(75.74%)。后續(xù)實驗均采用超濾離心管-冷凍干燥的方法進行流分濃縮。

2.2 SEC-RPLC方法

2.2.1樣品復(fù)雜度分析

組織蛋白質(zhì)組成較血清、細胞蛋白質(zhì)更為復(fù)雜,在當前的研究中,我們測試了使用SEC對組織來源的蛋白質(zhì)進行預(yù)分流來降低樣品復(fù)雜性的效率。

為了確定尺寸排阻色譜的分離效果,經(jīng)過SEC分離的蛋白質(zhì)流分用尿素復(fù)溶后,進行SDS-PAGE(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis)分析。通過SDS-PAGE(見圖2a)發(fā)現(xiàn)5個流分中的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量分布呈階梯狀下降,表明使用SEC可通過蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量大小進行分離,從而有效降低組織蛋白質(zhì)樣品的復(fù)雜度,且多次進樣分離,可對低豐度蛋白質(zhì)進行富集,有效提高低豐度蛋白質(zhì)的含量。經(jīng)過RPLC-MS分析后,對各個流分中鑒定的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量分布進行分析,可發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量分布范圍與SDS-PAGE結(jié)果相似,呈階梯狀下降,且各流分中蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的中位數(shù)亦呈梯度下降(50、818～39、963 Da)(見圖2b)。這說明SEC可降低蛋白質(zhì)樣品復(fù)雜度,多次進樣收集流分可有效富集低豐度蛋白質(zhì)。

2.2.2SEC-RPLC提高蛋白質(zhì)及肽段鑒定效率

如何在高度復(fù)雜的寬動態(tài)范圍樣品中鑒定低豐度蛋白質(zhì)是當今蛋白質(zhì)組學(xué)的主要挑戰(zhàn),在這種寬動態(tài)范圍下,高豐度蛋白質(zhì)與低豐度蛋白質(zhì)的濃度差異極大,高豐度蛋白質(zhì)的酶解肽段廣泛存在,導(dǎo)致該類肽段過度采集,最終使得低豐度蛋白質(zhì)的肽段信號被掩蓋或忽略。

圖 2 各流分蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量分布Fig. 2 Relative molecular mass distribution of proteins in each fraction a. SDS-PAGE of the protein fractions collected from size exclusion chromatography; b. median relative molecular mass of proteins in each fraction.

本文所建立的SEC-RPLC-MS方法與平行實驗的SCX-RPLC-MS方法[38]進行比較,可以發(fā)現(xiàn)SEC-RPLC方法中的色譜圖響應(yīng)高達2×107而SCX-RPLC僅能達到2×106。將各流分蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)合并重復(fù)項并去除冗余后,SEC-RPLC鑒定出1 345個蛋白質(zhì)和23 621個肽段;SCX-RPLC可鑒定出1 053個蛋白質(zhì)和13 935個肽段,即SEC-RPLC較SCX-RPLC可顯著提升肽段鑒定數(shù)量(1.69倍)及蛋白質(zhì)鑒定數(shù)量(1.28倍)(見圖3)。

圖 3 SEC-RPLC和SCX-RPLC鑒定的蛋白質(zhì)及肽段數(shù)量Fig. 3 Numbers of proteins and peptides identified by SEC-RPLC and strong cation exchange (SCX)-RPLC

對蛋白質(zhì)及肽段的pI值及GRAVY (grand average of hydropathicity)值進行比較(見圖4a, 4b),在SCX-RPLC與SEC-RPLC方法之間均無顯著性差異,其符合SEC通過蛋白質(zhì)大小進行分離蛋白質(zhì)的物理性質(zhì)而無傾向性。

對蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果進行蛋白質(zhì)GO(gene ontology)分析及分類,分析結(jié)果見圖4c, SEC-RPLC各細胞成分蛋白質(zhì)鑒定數(shù)均高于SCX-RPLC方法。通過降低蛋白質(zhì)樣品的復(fù)雜度,減少質(zhì)譜對高豐度蛋白質(zhì)肽段的過度采集,提高低豐度蛋白質(zhì)的濃度,最終增加細胞各成分低豐度蛋白質(zhì)肽段鑒定的可能性。其中,膜蛋白質(zhì)鑒定數(shù)有顯著提高(SEC-RPLC: 64; SCX-RPLC: 15);雖然該方法在膜蛋白質(zhì)的鑒定方面較商業(yè)專用試劑盒的鑒定數(shù)量(800～1 000)仍有較大差距,但商用試劑盒及傳統(tǒng)膜蛋白質(zhì)提取方法需要1 g以上的樣品,且多需使用專屬的去污劑對膜蛋白進行提取,導(dǎo)致非膜蛋白質(zhì)變性,無法與膜蛋白質(zhì)共同檢測[39,40]。

圖 4 SEC-RPLC和SCX-RPLC鑒定蛋白質(zhì)及肽段的物理性質(zhì)及細胞成分分析Fig. 4 Physical properties and cell component analysis of proteins and peptides identified by SEC-RPLC and SCX-RPLCa. pI value; b. GRAVY value; c. cell component.

2.2.3SEC-RPLC對PTM修飾蛋白質(zhì)的鑒定

蛋白質(zhì)的翻譯后修飾參與調(diào)控多種蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能,但翻譯后修飾的蛋白質(zhì)量僅占單個細胞蛋白質(zhì)總量的1%,使其難以被鑒定[17-19]。SEC-RPLC-MS方法鑒定的肽段數(shù)量較SCX-RPLC-MS方法提升程度顯著,但蛋白質(zhì)鑒定數(shù)增加相對較少,說明該方法可以提高蛋白質(zhì)鑒定的覆蓋率,進而可能使更多潛在的翻譯后修飾位點被檢測,從而提高翻譯后修飾被檢測的可能性。

為了確定SEC預(yù)分離技術(shù)鑒定潛在PTM蛋白質(zhì)的能力,我們比較了使用SEC-RPLC及SCX-RPLC分析的同一組腎臟蛋白質(zhì)復(fù)溶液。如圖5所示,在沒有預(yù)分離的情況下直接進行分析,SCX-RP方法鑒定出9 136個PTM肽段,而SEC-RP方法鑒定出17 656個修飾肽段,提高了近一倍。

5種常見翻譯后修飾的比較顯示(見圖6b),使用SEC-RPLC方法鑒定的最多的修飾是甲基化修飾肽段為9 599個,是SCX-RPLC鑒定數(shù)目的1.9倍;乙?；揎楇亩舞b定5 430個,是SCX-RPLC鑒定數(shù)目的1.9倍;氨基甲?；揎楇亩舞b定3 553個,是SCX-RPLC鑒定數(shù)目的1.7倍。位于蛋氨酸的氧化修飾肽段鑒定3 636個,是SCX-RPLC鑒定數(shù)目的1.9倍。

圖 6 SEC-RPLC和SCX-RPLC鑒定的大鼠腎臟 翻譯后修飾肽段Fig. 6 Post-translational modified peptides identified from rat kidney by SEC-RPLC and SCX-RPLC a. phosphorylated modified peptides; b. common post-translational modified peptides.

與未分離樣品(含磷酸化修飾的蛋白質(zhì)838個)相比,進行預(yù)分離的樣品鑒定到的含磷酸化修飾的蛋白質(zhì)數(shù)(1 171個)是SCX-RPLC鑒定數(shù)目的1.4倍(見圖6a)。先前的研究[41,42]表明,使用SCX或ERLIC(electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography)進行磷酸化修飾肽分級分離,然后進行IMAC(immobilized metal ion affinity chromatography)或TiO2純化,可以富集6 000多種磷酸化修飾肽段。在這里我們在絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸上鑒定了磷酸化修飾的肽段共6 665個,而在未分離的蛋白質(zhì)樣品中僅鑒定到3 415個磷酸化修飾肽段,增長近2倍。且絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸上修飾的肽段鑒定比例無顯著傾向性,這種改進可能是由于降低了蛋白質(zhì)樣品的復(fù)雜性,從而提高了在MS級別上的鑒定效率。我們的結(jié)果表明,SEC預(yù)分離與富集策略相結(jié)合,是鑒定蛋白質(zhì)修飾的有力方法,且對于不同的PTM修飾均有作用。

2.2.4主要腎臟蛋白質(zhì)的翻譯后修飾研究

圖 7 磷酸化修飾肽段二級質(zhì)譜圖Fig. 7 MS/MS spectra for phosphorylated peptides a. SPTN1_RAT Phospho-serine (S) (m/z 600.27240); b. LDHA_RAT Phospho-threonine (T) & Methyl-Aspartic acid (D) (m/z 670.84800); c. TERA_RAT Phospho-tyrosine (Y) (m/z 818.89579).

該項研究中,我們發(fā)現(xiàn)的多種被修飾的蛋白質(zhì)參與了腎臟關(guān)鍵生理功能的調(diào)節(jié)。我們將以3個磷酸化修飾蛋白質(zhì)為例進行介紹,它們是磷酸化的血影蛋白(SPTN1_RAT), L-乳酸脫氫酶A鏈(LDHA_RAT)和過渡性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)ATP酶(TERA_RAT)。如圖7所示,血影蛋白的修飾肽段653MNEVISLWK661的母離子雙電荷峰為[M+2H]2+m/z600.272 4,比相應(yīng)未修飾的肽段多79 Da,其中碎片離子b1～b7、y1未被修飾,y6～y8的碎片離子相對分子質(zhì)量增加了79 Da,結(jié)合二級質(zhì)譜推斷被修飾的位點為S658(見圖7a)。L-乳酸脫氫酶A鏈的修飾肽段318KSADTLWGIQK328的母離子雙電荷峰為[M+2H]2+m/z670.848 00,比相應(yīng)未修飾的肽段多94 Da,肽段碎片b1～b3相對分子質(zhì)量未增加,b4相對分子質(zhì)量增加了14 Da,可推測在D321上存在甲基化修飾,剩余相對分子質(zhì)量增加了79 Da,可推測存在磷酸化修飾,通過二級質(zhì)譜比對肽段碎片b1～b3、y1、y3相對分子質(zhì)量未增加,修飾肽段碎片b7、y8～y9的相對分子質(zhì)量均增加了94 Da,由此進一步推斷其被磷酸化修飾的位點為T322(見圖7b)。過渡性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)ATP酶的修飾肽段639LDQLIYIPLPDEK651的母離子雙電荷峰為[M+2H]2+m/z818.895 79,比相應(yīng)未修飾肽段多79 Da,其中b1～b4、y1、y4～y6未修飾,修飾肽段y8～y12的碎片離子相對分子質(zhì)量增加了79 Da,推斷磷酸化修飾位點為Y644(見圖7c)。

血影蛋白是腎素多蛋白復(fù)合物的重要組成部分,在腎臟細胞中起到調(diào)節(jié)膜蛋白質(zhì)及細胞完整性的作用[43]; L-乳酸脫氫酶A鏈參與丙酮酸合成(S)-乳酸途徑,從而影響腎臟細胞中ATP含量及能量供給[44];過渡性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)ATP酶為囊泡的形成提供ATP[45]。這些蛋白質(zhì)經(jīng)磷酸化后顯示出生理活性[43,44],且參與到腎臟的關(guān)鍵生理活性及功能中。除磷酸化修飾蛋白質(zhì)外,我們也鑒定出乙?；?、氨基甲酰化、甲基化、氧化等4種蛋白質(zhì)修飾,已有相關(guān)文獻[46-49]表明以上修飾與蛋白質(zhì)的代謝及穩(wěn)定性有關(guān),氧化修飾更可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)活性大變,并參與某些疾病的發(fā)展。利用SEC-RPLC-MS對蛋白質(zhì)翻譯后修飾進行研究,可鑒定到參與腎臟關(guān)鍵生理活性及功能的蛋白質(zhì)及修飾肽段,有利于更好地了解蛋白質(zhì)修飾,并有助于我們了解腎臟蛋白質(zhì)的正常生理功能及病理機理。

3 結(jié)論

我們的研究提出了SEC-RPLC-MS二維分離系統(tǒng),以鑒定大鼠腎臟蛋白質(zhì)中的微量蛋白質(zhì)及翻譯后修飾的蛋白質(zhì)。此處報告的數(shù)據(jù)表明,SEC-RPLC二維分離系統(tǒng)可顯著增強腎臟蛋白質(zhì)及肽段的鑒定,提高了蛋白質(zhì)覆蓋率。我們還展示了通過SEC-RPLC預(yù)分離技術(shù)提高PTM鑒定效率的可行性,特別是對磷酸化肽段的檢測。此方法可應(yīng)用于大鼠腎臟蛋白質(zhì)組分析,更好地了解蛋白質(zhì)修飾,并最終有助于我們解釋這些修飾在腎臟的正常生理功能維持和疾病發(fā)生中的潛在作用。