液液提取-固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定人體血液中16種有機(jī)磷酸酯

侯敏敏, 史亞利*, 蔡亞岐

(1. 中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心, 環(huán)境化學(xué)與生態(tài)毒理學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100083; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

近幾年,多溴聯(lián)苯醚(PBDEs)因具有持久性、長距離遷移性、生物累積性以及毒性而在世界范圍內(nèi)被禁止使用并且逐漸退出市場(chǎng),有機(jī)磷酸酯(OPEs)作為其優(yōu)良的替代品,生產(chǎn)量和使用量顯著增加,作為阻燃劑和增塑劑廣泛應(yīng)用于泡沫、塑料、紡織制品以及液壓油和各種建材產(chǎn)品中[1-3]。2015年,OPEs的全球使用量高達(dá)68萬噸,年使用增長率約為7.9%[4]。OPEs通過物理的方式添加進(jìn)各種消費(fèi)品中,因此很容易通過揮發(fā),磨損或者滲濾的方式釋放進(jìn)入到環(huán)境中[1]。目前,已經(jīng)有大量研究在大氣[5,6]、水體[6-8]、土壤[9]、沉積物[7,10]、灰塵[11,12]等多種環(huán)境介質(zhì)以及生物體[8,13]中檢出OPEs。此外,毒理學(xué)研究已經(jīng)證實(shí)部分OPEs的暴露可能會(huì)對(duì)人體及其他生物體造成不良影響,包括致癌性[14]、神經(jīng)毒性[15]、生殖毒性[16]、甲狀腺激素[17]和雌激素干擾效應(yīng)[18]、哮喘以及過敏性鼻炎[19]等。

環(huán)境介質(zhì)中的OPEs可通過呼吸、灰塵攝食、真皮吸收或者飲食進(jìn)入人體,進(jìn)而對(duì)人體健康造成危害。目前國內(nèi)外已經(jīng)有較多的研究在人體尿液[20,21]、血液[22-25]、頭發(fā)[26-28]、指甲[27]以及母乳[29,30]等樣品中檢測(cè)到OPEs的存在,表明了普遍的人體OPEs的暴露。進(jìn)入人體內(nèi)的OPEs很容易代謝成其二酯類或者羥基類的化合物,進(jìn)而通過尿液排出體外[31-34]。因此,目前大多數(shù)研究主要集中于尿液中OPEs代謝物的檢測(cè),將其作為人體OPEs暴露的生物標(biāo)志物[35]。然而,有些OPEs,如磷酸三(2-氯乙基)酯(TCEP),在人體內(nèi)的代謝速率較慢[31]。此外,尿液中某一種OPEs的代謝物可能是由多種不同的OPEs代謝產(chǎn)生,如磷酸三苯酯(TPHP)、2-乙基己基二苯磷酸酯(EHDPP)和間苯二酚雙(磷酸二苯酯)(RDP)均可以代謝產(chǎn)生磷酸二苯酯(DPHP)[31,36-38]。并且,有些OPEs二酯代謝物,如磷酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)、磷酸二丁酯(DnBP)和DPHP,有直接的生產(chǎn)和使用,并且已有研究在室內(nèi)灰塵和食品中檢測(cè)出它們的存在[39,40],表明這些物質(zhì)可能會(huì)直接暴露于人體。因此,對(duì)于某些OPEs,相比尿液中的代謝物,血液中母體物質(zhì)的檢測(cè)可能更能準(zhǔn)確反映人體對(duì)于OPEs的暴露。且因人體內(nèi)血液與各個(gè)器官和組織直接接觸,血液中化合物的濃度更能反映到達(dá)特定組織的劑量,進(jìn)而更準(zhǔn)確地評(píng)估人體健康風(fēng)險(xiǎn)。

目前,已有少量研究檢測(cè)了人體血液中OPEs的存在,通過使用不同的分析檢測(cè)方法,包括固相萃取(SPE)聯(lián)用GC-MS[41-43]和液液提取-雙SPE柱固相萃取和LC-MS/MS聯(lián)用[22,25]。但是,這些研究所檢測(cè)的OPEs種類相對(duì)較少。另外,隨著工業(yè)和科學(xué)研究的不斷推進(jìn),不斷有結(jié)構(gòu)性能各異的OPEs新產(chǎn)品被大量生產(chǎn)和使用,近幾年已經(jīng)有較多新型的OPEs在各種消費(fèi)品及其相關(guān)環(huán)境中檢出。因此,建立同時(shí)檢測(cè)人體血液樣品中多種OPEs的分析方法具有重要意義和迫切需求。本工作針對(duì)16種OPEs,通過優(yōu)化SPE等前處理方法和色譜-質(zhì)譜方法,建立了靈敏高效的同時(shí)檢測(cè)人體血液中多種OPEs的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法,為研究人體OPEs的暴露水平和積累特征提供方法基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Ultimate 4500液相色譜儀及Triple quadTM4500三重四極桿質(zhì)譜儀(MS/MS,美國AB SCIEX公司),系統(tǒng)配有電噴霧(ESI)離子源和Analyst 1.6.2工作站;氮吹濃縮儀;ENVI-18 SPE小柱(6 mL, 500 mg; Supelco)。

甲醇、乙腈(色譜純,美國Merck公司);二氯甲烷(色譜純,美國Fisher公司); Milli-Q超純水制備系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

16種目標(biāo)分析物信息如表1所示,其中TMP、TEP、TPrP、TnBP、TiBP、TEHP、TBOEP、TCEP、TCIPP、TDCPP、TPHP、TMPP、EHDPP和CDPP購自德國Dr. Ehrenstorfer公司;RDP、BABP、TCIPP-d18和TCEP-12購自加拿大Toronto Research Chemicals公司;內(nèi)標(biāo)TMP-d9、TEP-d15和TPrP-d21購自加拿大C/D/N Isotopes公司;TnBP-d27和TPHP-d15購自美國Cambridge Isotope Laboratories公司。

血液樣本:采集對(duì)象為山東省濟(jì)南市的15名健康老年人,所有參與志愿者在采樣前均詳細(xì)閱讀并簽署了知情同意書。

表 1 16種OPEs的英文全稱、簡(jiǎn)稱、分子式、相對(duì)分子質(zhì)量及CAS號(hào)

1.2 血液樣品前處理

參考文獻(xiàn)[44]的方法進(jìn)行樣品前處理(略有修改),并進(jìn)行驗(yàn)證。具體過程如下:血液解凍后取0.5 mL于15 mL玻璃離心管中,加入10 μL內(nèi)標(biāo)混合溶液(1 ng/μL),渦旋混勻后靜置30 min,再加入10 mL乙腈,搖床萃取12 h,離心后將上清液轉(zhuǎn)移至另一個(gè)干凈離心管中;再向殘余部分加入2 mL乙腈,按照上述步驟重復(fù)萃取兩次,每次30 min,最后將3次萃取所得上清液合并,氮吹濃縮至約0.5 mL,加入30 mL超純水稀釋待凈化。考慮到部分OPEs物質(zhì)容易揮發(fā),氮吹過程中氮?dú)饬魉僖砸好孑p微波動(dòng)即可,氮吹溫度為50 ℃。

依次用5 mL乙腈和5 mL超純水活化ENVI-18小柱,將萃取液加載到活化好的小柱上,上樣完成后先用10 mL的超純水清洗小柱;清洗液流干后,在負(fù)壓下對(duì)小柱抽干約40 min,之后用6 mL含有25%二氯甲烷的乙腈進(jìn)行洗脫,洗脫液氮吹至近干,甲醇定容至1 mL,通過0.22 μm的有機(jī)濾膜后進(jìn)行UPLC-MS/MS測(cè)定。

1.3 儀器檢測(cè)條件

色譜 色譜柱Acquity UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm),連接保護(hù)柱Acquity UPLC BEH C18(5 mm×2.1 mm);流動(dòng)相:A為5 mmol/L醋酸銨緩沖溶液,B為甲醇(MeOH);柱溫25 ℃,流速400 μL/min;梯度洗脫程序?yàn)?0～1 min, 10%B～40%B; 1～4 min, 40%B～90%B; 4～4.1 min, 90%B～100%B,維持4.9 min; 9～9.1 min, 100%B～10%B,維持3.9 min。

質(zhì)譜 電噴霧離子源(ESI),正離子多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式;針泵進(jìn)樣,在確定母離子和子離子對(duì)后,對(duì)解簇電壓(DP)、入口電壓(EP)、碰撞電壓(CXP)等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化(見表2)。接入色譜流動(dòng)相后,對(duì)其他參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果如下:氣簾氣壓為0.14 MPa,碰撞氣壓為0.02 MPa,離子源噴霧電壓為5 000 V,溫度為600 ℃,霧化氣為0.34 MPa,輔助霧化氣為0.28 MPa。

2 結(jié)果與討論

2.1 SPE柱的回收率

通過在ENVI-18 SPE柱上加載30 mL含100ng OPEs和10 ng內(nèi)標(biāo)的超純水溶液,考察了該SPE柱對(duì)16種目標(biāo)OPEs的回收率,16種OPEs的回收率為54.6%～104%(見表3), 7種內(nèi)標(biāo)TMP-d9、TEP-d15、TPrP-d21、TCIPP-d18、TCEP-12、TnBP-d27和TPHP-d15的回收率分別為61.3%±5.04%、70.8%±5.49%、99.1%±8.06%、113%±3.09%、98.9%±6.95%、96.6%±5.15%和95.9%±2.90%,該回收率滿足物質(zhì)分析的需求。

表 2 16種OPEs的質(zhì)譜參數(shù)

表 3 ENVI-18 SPE柱對(duì)16種OPEs的提取回收率

2.2 色譜柱和流動(dòng)相的選擇

本研究考察了Acclaim Mixed-Mode HILIC-1(150 mm×2.1 mm, 5 μm; Thermo Fisher)和Acquity UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm; Waters)2種類型的色譜柱對(duì)16種OPEs的分離和保留能力。Mixed-Mode HILIC-1色譜柱的固定相由疏水性烷基鏈組成,末端是二醇基團(tuán),這使其既具有疏水保留,又具有親水相互作用。BEH C18柱作為一種通用的C18色譜柱,適用于各種分析物的分離。比較結(jié)果表明,2種色譜柱均能對(duì)目標(biāo)化合物實(shí)現(xiàn)較好的分離,但個(gè)別疏水性的OPEs如TEHP等的分離,相比C18柱,它們?cè)贏cclaim Mixed-Mode HILIC-1柱上的保留時(shí)間較長,考慮到分析效率,本研究最終采用UPLC BEH C18色譜柱進(jìn)行16種OPEs的UPLC-MS/MS分析。

比較UPLC BEH C18色譜柱在甲醇-2 mmol/L、5 mmol/L、50 mmol/L乙酸銨水溶液3種流動(dòng)相組成條件下對(duì)16種OPEs分離的峰形和靈敏度,結(jié)果表明,當(dāng)采用5 mmol/L的乙酸銨水溶液時(shí),大多數(shù)OPEs的響應(yīng)略高且獲得良好分離。因此,本研究最終采用甲醇-5 mmol/L乙酸銨水溶液作為流動(dòng)相。16種OPEs標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖見圖1。

圖 1 16種OPEs標(biāo)準(zhǔn)品的總離子流色譜圖Fig. 1 Total ion chromatograms of the 16 OPE standards

2.3 方法學(xué)表現(xiàn)

按照優(yōu)化后的檢測(cè)條件測(cè)定0.1、0.5、2、5、10、20、50 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,以目標(biāo)物質(zhì)與內(nèi)標(biāo)的濃度比為橫坐標(biāo),峰面積比為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,結(jié)果表明,16種OPEs在0.1～50 ng/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系,線性相關(guān)系數(shù)均在0.995以上。檢出限(LOD)以3倍信噪比計(jì)算,結(jié)果見表4, 16種OPEs的LODs為0.003 8～0.882 ng/mL。

表 4 16種OPEs在人體血液中3個(gè)水平下的加標(biāo)回收率(n=3)

為了考察方法的有效性和精密度,進(jìn)行了基質(zhì)加標(biāo)回收試驗(yàn)。將之前采集的幾個(gè)志愿者的血液樣品混合,作為基質(zhì)。分別取0.5 mL的血液基質(zhì),加入2、20、40 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,每個(gè)濃度水平進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn),按照優(yōu)化的樣品前處理和檢測(cè)條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見表4,除TMP外,其余15種OPEs的基質(zhì)加標(biāo)回收率為53.1%～126%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.15%～12.6%。對(duì)于TMP,采用其氘代同位素TMP-d9作為內(nèi)標(biāo)物對(duì)TMP在樣品處理過程中的損失進(jìn)行校正,TMP-d9的加標(biāo)回收率為39.1%±3.97%。其余6種內(nèi)標(biāo)的加標(biāo)回收率為66.8%±6.85%～91.6%±3.52%。

2.4 樣品基質(zhì)效應(yīng)評(píng)估

本研究采用提取后添加法評(píng)估人體血液樣本的基質(zhì)效應(yīng)(ME),具體過程如下:分別取6個(gè)血液樣本,不添加任何目標(biāo)物質(zhì)以及內(nèi)標(biāo),根據(jù)樣品前處理過程進(jìn)行萃取凈化,將最終獲得的萃取液進(jìn)行混合(6 mL)作為基質(zhì)空白。取1 mL空白基質(zhì)加入10 ng的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和內(nèi)標(biāo),按照樣品檢測(cè)方法測(cè)定,獲得加標(biāo)基質(zhì)響應(yīng)(A)。另取1 mL空白基質(zhì),不加任何標(biāo)準(zhǔn)上機(jī)去檢測(cè),獲得空白基質(zhì)響應(yīng)(B),C為純?nèi)軇┲邢嗤瑵舛却郎y(cè)物質(zhì)的響應(yīng)。進(jìn)行3個(gè)平行,目標(biāo)化合物的基質(zhì)效應(yīng)通過如下公式計(jì)算:

結(jié)果表明,人體血液樣本中待測(cè)的16種OPEs的基質(zhì)效應(yīng)為56.4%±12.4%～103.0%±1.1%。其中,TCEP(88.6%±1.3%)和TCIPP(77.5%±4.3%)存在較弱的基質(zhì)抑制,可以通過其相應(yīng)的同位素內(nèi)標(biāo)(TCEP-d12(75.3%±8.9%)和TCIPP-d18(77.4%±7.5%))進(jìn)行消除。此外,RDP、TMPP、EHDPP和BABP存在明顯的基質(zhì)抑制,分別為75.8%±1.4%、68.4%±1.0%、56.4%±12.4%和58.5%±0.4%,這4種待測(cè)物質(zhì)沒有相應(yīng)的同位素內(nèi)標(biāo)。本研究采用內(nèi)標(biāo)法定量,使用TPHP-d15(77.4%±7.5%)作為它們的內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量,可以部分消除基質(zhì)效應(yīng)的影響,滿足分析要求。

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定

使用本研究建立的分析檢測(cè)方法,對(duì)采集的15個(gè)人體血液樣本中的OPEs進(jìn)行分析測(cè)定,結(jié)果見表5。16種OPEs的總濃度為1.50～7.99 ng/mL,除TMP、TEP、TPrP、CDPP、TMPP、BABP、RDP和TDCPP外,其余8種OPEs檢出率均高于50%。其中TiBP、TCEP和TCIPP的中位濃度最高,分別為0.813 ng/mL、0.764 ng/mL和0.690 ng/mL。

表 5 人體血液樣本的分析結(jié)果

3 結(jié)論

本工作建立了人體血液中16種有機(jī)磷酸酯阻燃劑的UPLC-MS/MS檢測(cè)方法,該方法僅需要0.5 mL血液樣品,前處理流程操作簡(jiǎn)便,目標(biāo)化合物和內(nèi)標(biāo)物獲得良好的回收率,檢測(cè)靈敏度高,重現(xiàn)性好,可以滿足人體血液中OPEs的檢測(cè)要求。