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    運(yùn)輸應(yīng)激對山羊小腸形態(tài)和熱休克蛋白表達(dá)的影響

    2021-12-17 03:37:46鄭文亞李國生方滿新胡迎東彭瑞妮
    中國畜牧雜志 2021年12期
    關(guān)鍵詞:腸絨毛空腸小腸

    鄭文亞,李國生,劉 犇,2,3*,方滿新,2,胡迎東,2,胡 威,2,彭瑞妮,2,3,高 凡

    (1.宜春學(xué)院生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院,江西宜春 336000;2.江西綠科農(nóng)牧科技有限公司,江西宜春 336000;3.江西省高等學(xué)校硒農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心,江西宜春 336000)

    現(xiàn)代動物生產(chǎn)中,養(yǎng)殖場與市場、屠宰場之間的畜禽安全運(yùn)輸是十分重要的一個環(huán)節(jié)[1]。然而在運(yùn)輸過程中,各種不良因素會導(dǎo)致動物的壓力增加,如陌生環(huán)境、禁食缺水、通風(fēng)不良、高溫或低溫、動物的裝卸、噪聲以及車廂環(huán)境的污染均會危害動物福利[2],增加發(fā)病率和死亡率[3]。而小腸作為消化、吸收和營養(yǎng)物質(zhì)代謝的重要場所[4],極易成為熱應(yīng)激、運(yùn)輸應(yīng)激和缺氧應(yīng)激等不良反應(yīng)的靶器官[5],某些消化系統(tǒng)疾病通常是由這些反應(yīng)引起的,例如食欲不振或亢進(jìn)、腹瀉或便秘等,嚴(yán)重時可能導(dǎo)致動物死亡。研究表明,運(yùn)輸應(yīng)激損害大鼠小腸并破壞某些重要基因的表達(dá)[6]。

    熱休克蛋白(HSPs)作為主要的應(yīng)激相關(guān)蛋白,由于其在細(xì)胞中的生理和保護(hù)作用通常被稱為分子伴侶[7]。當(dāng)細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài)時,HSPs 水平升高,促進(jìn)蛋白質(zhì)的正確折疊,維持蛋白質(zhì)的天然結(jié)構(gòu)和功能[8]。對于某些由應(yīng)激引起的胃腸道疾病,如胃潰瘍等,HSPs 可能起重要的保護(hù)作用[9]。此外,HSPs 家族中不同成員在正常和應(yīng)激條件下表現(xiàn)出不同的功能[10]。其中,HSP90在細(xì)胞適應(yīng)應(yīng)激,維持正常細(xì)胞功能中起重要作用[11],HSP70 家族被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)有效的應(yīng)激緩沖體系[12],而HSP27 在細(xì)胞發(fā)育、免疫功能調(diào)節(jié)和疾病防治中均發(fā)揮重要作用[13]。本研究旨在探討運(yùn)輸應(yīng)激對山羊小腸顯微和超微結(jié)構(gòu)的損傷及其對熱休克蛋白表達(dá)的影響,對于臨床上緩解運(yùn)輸應(yīng)激所帶來的危害有重要意義。

    1 材料與方法

    1.1 主要試劑 蘇木精、伊紅染液購自北京夢怡美生物科技有限公司,小鼠SP 免疫組化試劑盒及濃縮二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,HSP27(ab79868)、HSP70(ab5439)、HSP90(ab13492)以及山羊抗小鼠IgG(ab6789)購自abcam 公司,小鼠抗β-actin 內(nèi)參蛋白(BM0627)和免疫印跡技術(shù)彩色預(yù)染蛋白Marker(AR1113)購自博士德生物,4× 蛋白上樣緩沖液(AI11800A)購自TAKARA 公司,超敏化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(GS0720)購自US EVERBRIGHT INC 公司。

    1.2 實(shí)驗(yàn)動物處理 隨機(jī)選擇體重(13.89±2.96 kg)、體況相似的12 只健康贛西公山羊,分為3 組,分別為對照組(不運(yùn)輸)、運(yùn)輸應(yīng)激2 h 組、運(yùn)輸應(yīng)激6 h 組,每組4 只,溫度28~32℃(實(shí)驗(yàn)時間為2018 年7 月28日),禁食、禁水以35~45 km/h 的速度進(jìn)行公路運(yùn)輸。頸部快速放血致死后迅速采取山羊十二指腸、空腸和回腸,部分放入4% 多聚甲醛和2.5% 戊二醛中固定,部分放入液氮中速凍后轉(zhuǎn)入-80℃超低溫冰箱保存,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    1.3 病理學(xué)研究 將4%多聚甲醛溶液固定48 h 以上的十二指腸、空腸及回腸組織,流水沖洗24 h 以上,后經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋制成組織切片,進(jìn)行HE 染色后于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行拍照,觀察其病理變化。將2.5%戊二醛固定液中固定72 h 的十二指腸、空腸及回腸組織置于1%的鋨酸中固定,常規(guī)脫水、包埋后用超薄切片機(jī)進(jìn)行切片,經(jīng)醋酸鈾-枸櫞酸鉛染色后置于透射電鏡下觀察并進(jìn)行拍攝。

    1.4 免疫組織化學(xué) 將制備好的小腸組織石蠟切片進(jìn)行烘片、脫蠟、微波抗原修復(fù)后,依據(jù)小鼠SP 免疫組織化學(xué)試劑盒操作要求進(jìn)行操作,HSP27、HSP70、HSP90 均按1:400 稀釋,設(shè)置陰性對照(一抗用PBS代替)。DAB 顯色后蘇木精復(fù)染,鹽酸酒精分化,返藍(lán)后脫水、透明、封片,立即進(jìn)行觀察和拍照,出現(xiàn)黃色或棕色即為陽性表達(dá)。

    1.5 免疫印跡技術(shù) 取小腸組織充分研磨碾碎、加入裂解液裂解后用組織細(xì)胞總蛋白抽提試劑盒按操作步驟提取總蛋白,采用BCA 法測定蛋白濃度,并將實(shí)驗(yàn)組和對照組的總蛋白濃度調(diào)為一致。將制備好的蛋白液上樣后采用聚丙烯酰胺凝膠電泳2 h,PVDF 膜濕轉(zhuǎn)50 min,TBST 洗滌后封閉2 h,將膜裁剪成適宜大小后用TBST洗滌3 次,10min/ 次;4℃條件下放入一抗(HSP27、HSP70、HSP90 分別按1:5000、1:1000、1:1000 稀釋)與小鼠抗β-actin(1:1000 稀釋)孵育18 h,TBST 洗滌3 次,10min/次;室溫下孵育山羊抗小鼠IgG(HSP27、HSP70、HSP90 分別以1:8000、1:20000、1:2000 稀釋)、內(nèi)參蛋白(1:1000 稀釋)2h,TBST 洗滌3 次,10min/次。最后將PVDF 膜按照HRP-ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒的說明進(jìn)行成像,AI600 化學(xué)發(fā)光成像儀拍照。用Image Pro Plus 6.0 軟件對采集的條帶圖像進(jìn)行密度值分析,目的蛋白與相對應(yīng)的內(nèi)參蛋白條帶的密度值比值記為測試值。

    1.6 實(shí)時熒光定量PCR 實(shí)時熒光定量PCR 在之前報(bào)道方法[14]的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)。使用組織RNA 試劑盒(R6812,Omega,USA)分離總RNA,并使用第一鏈cDNA 合成的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)預(yù)混液試劑盒(AT301,TransGen,China)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用Top Green qPCR SuperMix 試劑盒(AQ131,TransGen)在CFX96 TouchTM實(shí)時系統(tǒng)(Bio-Rad,USA)上擴(kuò)增cDNA,表1 列出了所使用的引物序列。通過2-ΔΔCt方法分析實(shí)時熒光定量PCR 的數(shù)據(jù),將相對表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化為β-肌動蛋白的表達(dá)水平。

    表1 實(shí)時熒光定量PCR 引物序列

    1.7 統(tǒng)計(jì)分析 使用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,單因素方差分析后再進(jìn)行LSD 多重比較。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,P<0.05 表示有顯著差異,P≥0.05 表示無顯著差異。

    2 結(jié)果

    2.1 運(yùn)輸應(yīng)激山羊小腸的顯微病理學(xué)觀察 如圖1 所示,與對照組相比,運(yùn)輸應(yīng)激后小腸組織結(jié)構(gòu)均有損傷,主要發(fā)生在固有層,固有層炎性細(xì)胞浸潤十分明顯,十二指腸和空腸多為淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤,回腸主要為中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤,此外,固有層充血出血,腺上皮破損、變性。十二指腸和空腸固有層細(xì)胞變性壞死,中央乳糜管擴(kuò)張,部分管腔中可見壞死脫落的細(xì)胞碎屑(圖1-B1),炎性細(xì)胞浸潤明顯(圖1-C1),毛細(xì)血管充血出血(圖1-B2),腸上皮細(xì)胞發(fā)生壞死、融合(圖1-C2)。少量回腸黏膜上皮細(xì)胞變性壞死,固有層炎性細(xì)胞浸潤(圖1-B3、1-C3),腺體結(jié)構(gòu)不完整,嚴(yán)重者腺體結(jié)構(gòu)崩解,腺上皮細(xì)胞變性壞死,胞核碎裂溶解,胞質(zhì)淡染出現(xiàn)空泡化,毛細(xì)血管充血出血(圖1-B3)。

    圖1 山羊小腸顯微病理學(xué)觀察(HE 染色,400×)

    2.2 運(yùn)輸應(yīng)激山羊小腸的超微病理學(xué)觀察 透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn),運(yùn)輸應(yīng)激組十二指腸柱狀上皮細(xì)胞微絨毛彎曲、倒伏,線粒體增生、腫脹和空泡化,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)不完整、膜破裂,細(xì)胞核固縮、核膜內(nèi)陷,染色質(zhì)凝集邊移,電子密度增高(圖2 A1-C1)。空腸上皮細(xì)胞微絨毛也發(fā)生彎曲、倒伏,大量高電子密度的神經(jīng)內(nèi)分泌顆粒出現(xiàn)在細(xì)胞頂部,線粒體增殖聚集,呈圓形、細(xì)長型或S 形,部分出現(xiàn)腫脹、嵴斷裂、內(nèi)部結(jié)構(gòu)模糊等現(xiàn)象,細(xì)胞核異常,有不同程度的固縮、壞死和凋亡,電子密度高(圖2 A2-C2)?;啬c柱狀上皮細(xì)胞微絨毛彎曲、倒伏,部分核濃縮、形狀不規(guī)則,核膜內(nèi)陷或破裂,異染色質(zhì)凝集邊移,胞質(zhì)中可見較多囊泡和小管,糖原豐富,線粒體增生,集中在微絨毛下方,形態(tài)各異,部分線粒體腫脹、嵴消失、內(nèi)部結(jié)構(gòu)模糊(圖2 A3-C3)。

    圖2 山羊小腸超微病理學(xué)觀察(醋酸鈾-枸櫞酸鉛染色)

    2.3 山羊小腸三種熱休克蛋白的表達(dá)定位 HSP27 在十二指腸腸絨毛黏膜上皮細(xì)胞表達(dá),且主要在胞質(zhì)中表達(dá),呈黃色,固有層白細(xì)胞有少量表達(dá),在腸腺周圍組織中表達(dá)較多,呈黃色或淺黃色(圖3-A1、B1、C1);HSP70 在十二指腸主要表達(dá)于絨毛黏膜上皮細(xì)胞胞漿中,呈黃色,在固有層有少量白細(xì)胞表達(dá),呈黃色或棕黃色,其他部位則無表達(dá)(圖3-D1、E1、F1);HSP90 在十二指腸的表達(dá)主要出現(xiàn)在腸絨毛黏膜上皮細(xì)胞胞核及胞質(zhì)中,呈淺黃色(圖3-G1、H1、I1)??漳cHSP27 主要表達(dá)部位在腸絨毛黏膜上皮細(xì)胞胞質(zhì),而基底部、小腸腺周圍組織表達(dá)較少(圖3-A2、B2、C2);空腸HSP70 主要在腸絨毛黏膜上皮細(xì)胞胞質(zhì)中表達(dá),在固有層僅腸絨毛處有少量白細(xì)胞表達(dá),其他部位則無表達(dá)(圖3-D2、E2、F2);HSP90 在腸絨毛上皮及小腸腺上皮細(xì)胞表達(dá),表達(dá)主要在細(xì)胞核,呈棕色或淺棕色(圖3-G2、H2、I2)。HSP27 在回腸腸絨毛黏膜上皮細(xì)胞胞質(zhì)有表達(dá),呈深棕色或棕色,固有層結(jié)締組織、壞死脫落的細(xì)胞碎屑以及白細(xì)胞均有表達(dá),呈棕黃色,小腸腺上皮也有表達(dá),呈淺黃色,小腸腺周圍白細(xì)胞及結(jié)締組織表達(dá)呈棕黃色(圖3-A3、B3、C3);HSP70 在回腸表達(dá)量少,僅在腸絨毛黏膜上皮細(xì)胞胞質(zhì)有表達(dá),呈黃色或淺黃色(圖3 D3、E3、F3);HSP90 在回腸主要在腸絨毛黏膜上皮細(xì)胞胞核表達(dá),呈棕色或棕黃色,在小腸腺上皮也表達(dá),呈棕色或淺棕色,在集合淋巴小結(jié)中,大量淋巴細(xì)胞表達(dá),胞核呈棕色(圖3G3、H3、I3)。

    圖3 山羊小腸HSP27、HSP70 和HSP90 蛋白的表達(dá)情況(400×)

    2.4 山羊小腸熱休克蛋白mRNA 和蛋白的定量表達(dá)情況與對照組相比,運(yùn)輸應(yīng)激后山羊十二指腸中HSP27 的mRNA 水平在2、6 h 運(yùn)輸應(yīng)激組均上調(diào)(P<0.05),HSP70 僅在6 h 運(yùn)輸應(yīng)激組上調(diào)(P<0.05),而HSP90 mRNA 水平無顯著變化(圖4-A),運(yùn)輸應(yīng)激后HSP27、HSP70 蛋白表達(dá)水平無變化,而6 h 運(yùn)輸應(yīng)激組HSP90 蛋白表達(dá)水平增加(P<0.05,圖4-B、C)。與對照組相比,運(yùn)輸2 h 組山羊空腸HSP90 mRNA 水平上調(diào)(P<0.05),運(yùn)輸2 h 組和6 h 組HSP70 mRNA水平均增加(P<0.05,圖4-D),但3 種蛋白的表達(dá)量均沒有變化(P>0.05,圖4-E、F)。與對照組回腸相比,HSP27 mRNA 和蛋白水平在2 h 組均下調(diào)(P<0.05),HSP70 mRNA 和蛋白水平在2 h 組增加(P<0.05),HSP90 mRNA 和蛋白水平在2 h、6 h 運(yùn)輸應(yīng)激后均無變化(圖4-G、H、I)。

    圖4 運(yùn)輸應(yīng)激對山羊小腸HSP27、HSP70 和HSP90 mRNA 和蛋白水平的影響

    3 討 論

    運(yùn)輸常導(dǎo)致動物體重下降、免疫力降低和肉品質(zhì)下降[15-16],還會破壞反芻動物瘤胃生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定,使菌群發(fā)生變化、釋放內(nèi)毒素、對病原微生物的抵抗能力減弱,從而增加消化道感染的風(fēng)險[15,17]。腸道具有營養(yǎng)吸收和屏障2 個重要功能[2],尤其是腸道屏障功能的完整性對機(jī)體健康十分重要[18-19],腸道屏障功能受損后極易引起各種胃腸道及胃腸道之外的疾病,包括肝病、代謝綜合征與肥胖癥等[20-22]。有研究報(bào)道大鼠空腸在運(yùn)輸后出現(xiàn)損傷,可能與細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激及激素失衡有關(guān)[6];此外,熱應(yīng)激時豬腸道也會出現(xiàn)明顯損傷,包括腸絨毛頂端受損、上皮細(xì)胞脫落、腸黏膜固有層暴露、絨毛高度和隱窩深度降低等[23-24]。本研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)輸后小腸絨毛結(jié)構(gòu)不完整,細(xì)胞壞死脫落,出現(xiàn)較多的炎性細(xì)胞浸潤及充血出血現(xiàn)象,腸上皮細(xì)胞微絨毛倒伏彎曲,胞核固縮,線粒體腫脹、嵴斷裂,以上結(jié)果表明運(yùn)輸應(yīng)激對山羊小腸造成了一定的結(jié)構(gòu)損傷,將會致使腸道通透性增加、細(xì)菌發(fā)生易位,影響其吸收和屏障功能,從而造成運(yùn)輸后腹瀉等疾病發(fā)生率升高[25]。

    HSPs 能夠作為分子伴侶參與蛋白質(zhì)的折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)和分配,在各種不良環(huán)境條件下,HSPs 可從細(xì)胞中釋放,維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài),并可激活多種調(diào)控蛋白,阻斷細(xì)胞凋亡[26]。不同家族的HSPs 在正?;驊?yīng)激條件下其功能也不一樣,其中HSP90 對細(xì)胞發(fā)揮正常功能以及對應(yīng)激的適應(yīng)起著重要作用,HSP90 作為分子伴侶,可以保護(hù)蛋白質(zhì)免受降解,并能與多種信號分子形成復(fù)合物,以維持細(xì)胞的生長和生存[27],HSP90 在體外保護(hù)小腸上皮細(xì)胞免受過氧化氫或吲哚乙酸誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷方面發(fā)揮重要作用,通過調(diào)控HSP90 過表達(dá)可提高對小腸上皮細(xì)胞的保護(hù)作用[28]。另有研究發(fā)現(xiàn)在豬運(yùn)輸應(yīng)激過程中,由于胃及心臟中HSP90 水平都顯著下降,造成其消化道和心臟出現(xiàn)損傷[27,29]。本研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)輸6 h 后山羊十二指腸HSP90 蛋白表達(dá)水平升高,運(yùn)輸2 h 后山羊空腸HSP90 mRNA 水平上調(diào),HSP90 的上調(diào)可能與緩解運(yùn)輸應(yīng)激造成的腸道損傷有關(guān)。

    HSP70 能增強(qiáng)細(xì)胞對環(huán)境變化和致病條件的耐受性,提高細(xì)胞存活率[4]。在大鼠早期腸黏膜燙傷模型中,HSP90 和HSP70 總含量顯著升高,從而保護(hù)腸黏膜細(xì)胞和黏膜屏障[30],可見在HSP90 發(fā)揮保護(hù)作用的同時,腸道細(xì)胞還可通過增加HSP70 的表達(dá)來抵抗應(yīng)激。HSP70 被認(rèn)為是保護(hù)腸上皮細(xì)胞免受有害物質(zhì)侵襲,防治潰瘍的重要物質(zhì),其表達(dá)可以促進(jìn)細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞凋亡,促進(jìn)蛋白合成,從而加速潰瘍的愈合[4],另外,HSP70 的表達(dá)還能夠調(diào)節(jié)腸道內(nèi)消化酶的活性,從而改善腸道消化吸收功能[5],研究表明HSP70 還可在熱應(yīng)激誘導(dǎo)下通過絲裂原活化蛋白激酶信號通路的激活發(fā)揮對大鼠小腸損傷的保護(hù)作用[31]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示運(yùn)輸6 h 后山羊十二指腸HSP70 mRNA 水平升高,運(yùn)輸2 h和6 h 后山羊空腸HSP70 mRNA 水平增加,山羊回腸HSP70 mRNA 和蛋白水平在運(yùn)輸2 h 后明顯增加,提示HSP70 的上調(diào)對運(yùn)輸應(yīng)激山羊小腸可能起著重要的保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)輸應(yīng)激后山羊十二指腸中HSP27的mRNA 水平在2 h 組、6 h 組均升高,HSP27 作為小分子HSPs 家族的一員,能夠維持細(xì)胞骨架與刺激細(xì)胞增殖[26,29],HSP27 主要通過參與細(xì)胞死亡途徑(如壞死、凋亡或自噬)來保護(hù)細(xì)胞免受其他致命條件的傷害[32],當(dāng)腸上皮細(xì)胞受損時,HSP27 的磷酸化可作為腸上皮細(xì)胞反應(yīng)激活的一種新型信號通路,使腸道能夠快速重建腸上皮黏膜屏障,從而保護(hù)腸道的完整性[33]。

    總之,運(yùn)輸應(yīng)激會對山羊小腸顯微和超微結(jié)構(gòu)造成一定程度的損傷,運(yùn)輸后三種熱休克蛋白表達(dá)量的變化提示其可能對運(yùn)輸應(yīng)激山羊小腸起著一定的保護(hù)作用。

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