忍冬褐斑病病原菌鑒定及生物學特征分析

李 麗，孫承龍，喬永剛，路媛媛

（1.山西農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，山西太谷030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學園藝學院，山西太谷030801）

忍冬（Lonicera japonica Thunb）屬忍冬科忍冬屬[1]。忍冬花是清火解毒的良品，對各種化膿性疾病均有一定的作用效果；忍冬藤對多種感染性疾病也有一定的療效[2-4]。

隨著忍冬種植面積的擴大，生態(tài)環(huán)境逐步惡化，忍冬感病率也逐漸上升[5]。褐斑病是忍冬葉部常見病害，發(fā)病初期，病斑呈黃褐色、點狀；隨著發(fā)病時期延長，病斑逐漸擴大，為圓形或多角形；嚴重時導致葉片枯黃、脫落，影響植株正常生長及開花，造成大面積減產(chǎn)[6-7]。褐斑病的發(fā)病時期為植株中后期，多發(fā)生在8—9月，高溫高濕環(huán)境下發(fā)病較重，其病原菌的越冬場所多為病葉[8-10]。

目前，對于忍冬褐斑病的相關研究相對較少，大多數(shù)停留于褐斑病的物理和化學防治，如摘除病葉和適當修剪，用多菌靈、百菌清或用波爾多液噴霧防治，但未對其致原菌進行深入的研究。

本研究通過對引起忍冬褐斑病的病原菌的生物學特征進行系統(tǒng)研究，旨在為有效防治該病害提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

忍冬褐斑病病葉采集于山西農(nóng)業(yè)大學生命科學學院中藥試驗田。

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g，瓊脂20 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 L；查氏培養(yǎng)基：硝酸鈉2 g，磷酸氫二鉀1 g，氯化鉀0.5 g，七水硫酸鎂0.5 g，硫酸亞鐵0.01 g，蔗糖30 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 L[11]。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌的分離與鑒定 采用組織分離法對引起該病害的病原菌進行分離[12]。將病葉的病健交界處剪為1.0 cm×0.5 cm的小塊，依次放入0.1%升汞消毒10 s、75%酒精消毒30 s，無菌水沖洗3次后，在無菌濾紙上吸干水分，放置于PDA培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)2～3 d；待小葉片上長出病原菌，用鑷子夾取少量菌絲，放置于新的PDA平板上培養(yǎng)5～7 d；產(chǎn)孢后，用消毒好的手術刀輕輕刮取少量菌絲，加入10 mL無菌水進行充分混合，過濾后用無菌水稀釋，配制為1.0×107個/mL孢子懸浮液。涂布棒蘸取適量懸浮液，涂在PDA培養(yǎng)基平板上，挑取單孢進行純化；純化得到的病原菌參考SUTTON[13]和BOEREMA等[14]的方法進行形態(tài)學鑒定，4℃保存。

1.2.2 柯赫氏法則驗證 將配置好的孢子懸浮液（1.0×107個/mL）對消過毒的健康葉片采用噴霧法接種，每10個葉片噴灑2 mL，對照組同時噴施蒸餾水[15]，放置在鋪有濕潤濾紙的托盤中，25℃保濕2～3 d（期間噴灑營養(yǎng)液（6-BA），保持葉片的營養(yǎng)），7 d后觀察葉片癥狀；當出現(xiàn)癥狀后，需要對病原菌重新分離培養(yǎng)（方法同1.2.1），將2次分離得到的菌株進行比對。

1.2.3 不同因素對菌絲生長和孢子形成的影響

1.2.3.1 碳源的影響 以PDA培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，分別用相同量的蔗糖、果糖、D-甘露醇、木糖、可溶性淀粉替換其中的葡萄糖，以制成含有不同碳源的培養(yǎng)基。

菌絲生長測定方法：將病原菌在PDA培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)5～7 d，在菌落邊緣打取菌餅（直徑9 mm）放置于待測培養(yǎng)基中央，25℃室溫培養(yǎng)，每天同一時間段，對菌落的生長情況進行觀察，采用十字交叉法[16]，測定菌落直徑并詳細記錄，每個處理重復3次。

產(chǎn)孢量測定方法：將病原菌在PDA培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)5～7 d，使菌落生長成熟，得到供試接種病原菌；在超凈工作臺中，用9 mm金屬打孔器在菌落邊緣打取菌餅，用接種針將菌餅置于待測培養(yǎng)基平板中央，25℃培養(yǎng)5～7 d；用相同體積（10 mL）的無菌水進行沖洗，擦凈紙過濾，血球計數(shù)板測定產(chǎn)孢量，每處理重復5次。

1.2.3.2 氮源的影響 以查氏培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，分別用相同量的甘氨酸、蛋白胨、硝酸鉀、硫酸銨、脲、苯丙氨酸替換其中的硝酸鈉，以配成含有不同氮源的培養(yǎng)基。菌絲生長和產(chǎn)孢量測定方法同

1.2.3.1 。

1.2.3.3 pH的影響 用0.5 mol/L鹽酸和1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PDA培養(yǎng)基的pH值，以1為間隔設置梯度，范圍4～11。菌絲生長和產(chǎn)孢量測定方法同1.2.3.1。

1.2.3.4 光照條件的影響 將病原菌在PDA培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)5～7 d，在菌落邊緣打取菌餅（直徑9 mm）放置于PDA培養(yǎng)基中央，將其置于全光照、光暗交替、黑暗3種條件下，25℃室溫培養(yǎng)。菌絲生長和產(chǎn)孢量測定方法同1.2.3.1。

1.2.4 不同因素對孢子萌發(fā)的影響

1.2.4.1 碳源的影響 如1.2.3.1中的不同碳源先配制成濃度為1%的液體，再配制成1.0×108個/mL孢子懸浮液；取一滴孢子懸浮液于載玻片上，隨后將有孢子懸浮液的一面朝下，放置在培養(yǎng)皿內(nèi)的U形玻棒上，皿底用吸水濾紙，25℃保濕培養(yǎng)，經(jīng)過8 h后鏡檢孢子萌發(fā)情況，每個重復觀察100個孢子，并計算萌發(fā)率，每個處理設置3個重復。

1.2.4.2 氮源的影響 用1.2.3.2中的不同氮源配制成濃度均為1%的液體，培養(yǎng)和測定方法同1.2.4.1。

1.2.4.3 pH的影響 同1.2.3.3中用鹽酸（0.5 mol/L）和氫氧化鈉（1 mol/L）溶液調(diào)節(jié)無菌水pH值梯度為3.0～11.0，間隔為1。用上述梯度溶液配制成濃度為1.0×108個/mL的孢子懸浮液。培養(yǎng)和測定方法同1.2.4.1。

1.2.4.4 光照的影響 用無菌水配制濃度為1.0×108個/mL孢子懸浮液，將載玻片放置于全光照、光暗交替、黑暗3種條件下，25℃室溫培養(yǎng)8 h后鏡檢孢子萌發(fā)率。培養(yǎng)和測定方法同1.2.4.1。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用軟件SPSS 24.0對試驗數(shù)據(jù)進行相關統(tǒng)計分析[17]；并采用Ducan方法進行單因素方差分析，檢驗數(shù)據(jù)的差異顯著性（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 病害癥狀描述

田間觀察，葉片是褐斑病病害主要發(fā)生的部位；發(fā)病初期，葉片上的病斑不規(guī)則，顏色較淺，為淡黃色；發(fā)病中后期，葉片上的病斑范圍逐漸擴大，為圓形或多角形，顏色變深，成深黃色至黃褐色，病健交界處明顯（圖1）。在濕度非常高的條件下，葉片會產(chǎn)生灰黑色霉狀物，導致葉片破碎，穿孔，最后脫落。

2.2 柯赫氏法則結果

采用噴霧法對健康忍冬葉片進行人工接種，試驗結果顯示，接種3 d后葉片開始出現(xiàn)癥狀，發(fā)病初期為褪綠色小點，隨后病斑變大呈圓形，褪綠色加重至黃色；隨著接種時間的延長，7 d后多個病斑融合在一起，病斑面積逐漸增大，成倒三角形至不規(guī)則形，顏色由黃色變?yōu)辄S褐色，病健交界處明顯，而對照組無明顯癥狀（圖2）。人工接種產(chǎn)生的病害癥狀與在田間采集病害葉片的癥狀非常相似，從接種發(fā)病的植物上采用組織分離法重新分離病原菌，經(jīng)鑒定，結果與田間植株上分離得到的相同。接種試驗結果說明，供試分離得到的病原菌是引起忍冬褐斑病的病原菌。

2.3 病原菌鑒定結果

經(jīng)柯赫氏法則確定的病原菌，在PDA上培養(yǎng)生長，約7 d長滿皿（Φ＝90 mm），菌落初期氣生菌絲較多，稀疏，呈白色；隨著培養(yǎng)時間的延長，氣生菌絲變厚，呈絨狀，菌絲顏色加深呈黃褐色（圖3-A）。顯微觀察顯示，病原菌孢子橢圓形至圓柱形，無色，單胞，無油滴，（3.6～6.0）μm×（2.0～3.1）μm（圖3-B），分生孢子器埋生或半埋生在培養(yǎng)基中，呈褐色至黑褐色，球形或近球形，154～240 μm（圖3-C）。參考SUTTON[13]和BOEREMA等[14]進行形態(tài)學鑒定，確定該病原菌為多喙莖點霉（Phoma multirostrata）。

2.4 不同因素對病原菌生長速率和產(chǎn)孢量的影響

2.4.1 碳源的影響 結果表明（表1），多喙莖點霉可以消耗多種碳源進行生長，但在不同碳源上生長速率和產(chǎn)孢量存在明顯差異。在以甘露醇為碳源的培養(yǎng)基上，該病原菌的菌絲生長速率顯著高于含有其他碳源的培養(yǎng)基（P＜0.05），甘露醇為最適碳源；在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基上生長速率最慢，且與其他碳源間差異顯著（P＜0.05）。在利用可溶性淀粉、果糖、木糖和蔗糖生長的菌絲無明顯差異。在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基上該病原菌的產(chǎn)孢量顯著高于含有其他碳源的培養(yǎng)基（P＜0.05），其產(chǎn)孢量大小為葡萄糖＞木糖＞蔗糖＞果糖＞甘露醇＞可溶性淀粉。

表1 不同碳源對多喙莖點霉菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響

2.4.2 氮源的影響 多喙莖點霉可以在含有多種氮源的培養(yǎng)基上生長，但生長速率和產(chǎn)孢量有一定的差異。在以硝酸鈉為氮源的培養(yǎng)基上，菌絲生長速率顯著高于含有其他氮源的培養(yǎng)基（P＜0.05），其次依次為蛋白胨、硝酸鉀、甘氨酸、苯丙氨酸和脲，最不利于病原菌生長的氮源是硫酸銨（表2）。在以硫酸銨為氮源的培養(yǎng)基上該病原菌的產(chǎn)孢量顯著高于含有其他氮源的培養(yǎng)基（P＜0.05），其次依次為硝酸鉀＞硝酸鈉＞蛋白胨＞甘氨酸＞苯丙氨酸，多喙莖點霉在以脲為氮源的培養(yǎng)基上不產(chǎn)孢（表2）。

表2 不同氮源對多喙莖點霉菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響

2.4.3 pH的影響 在本試驗設置的不同pH值對多喙莖點霉的生長速率和產(chǎn)孢量均有影響。在pH值4～11的范圍時，病原菌均可生長，但其生長速率存在明顯差異，當pH值為5時，生長速率達到最大值，為8.43 mm/d，為該病原菌生長最適pH值；當pH值為7時，產(chǎn)孢量達到最大值，為1.33×106個/mL，且與其他pH值間差異顯著（P＜0.05），為該病原菌產(chǎn)孢的最適pH值（表3）。

表3 不同pH對多喙莖點霉菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響

2.4.4 光照條件的影響 在不同的光照條件下多喙莖點霉都能生長。多喙莖點霉的產(chǎn)孢量在3種光照條件下無顯著差異；但在全光照條件下，病原菌菌絲的生長速率顯著高于其他2種光照條件（P＜0.05）（表4）。

表4 不同光照條件對多喙莖點霉菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響

2.5 不同因素對病原菌孢子萌發(fā)的影響

2.5.1 碳源的影響 圖4結果顯示，多喙莖點霉的分生孢子在不同碳源的溶液中萌發(fā)率存在較大差異。分生孢子在果糖中的萌發(fā)率顯著高于其他碳源（P＜0.05），為64.4%；甘露醇次之，為56.4%；病原菌在葡萄糖、蔗糖、木糖中的萌發(fā)率分別為36.7%、33.3%、26.5%；在可溶性淀粉中萌發(fā)率顯著低于其他碳源（P＜0.05），為4.5%。

2.5.2 氮源的影響 不同氮源對多喙莖點霉的萌發(fā)率有一定差異，但整體萌發(fā)率均不高。在硫酸銨中孢子萌發(fā)率顯著高于其他氮源（P＜0.05），為37.6%；其次依次為硝酸鉀和硝酸鈉，萌發(fā)率分別為26.1%和20.3%；在苯丙氨酸和甘氨酸中萌發(fā)率均低于10%；在蛋白胨和脲中分生孢子不萌發(fā)。表明苯丙氨酸、甘氨酸、蛋白胨和脲對多喙莖點霉的孢子萌發(fā)存在抑制作用（圖5）。

2.5.3 pH的影響 分生孢子在pH值4～11呈現(xiàn)規(guī)律性變化。在pH值4～7時，孢子萌發(fā)率逐漸升高，pH值為7時達到最大值，為56.7%，顯著高于其他pH值（P＜0.05）；當pH＞7時，孢子萌發(fā)率開始降低，pH值為11時降至30.3%；整個pH值梯度中，pH值為4時孢子萌發(fā)率最低，僅為21.0%。綜上表明，孢子萌發(fā)最適pH值為6～8，過酸和過堿條件都不利于多喙莖點霉的孢子萌發(fā)（圖6）。

2.5.4 光照的影響 黑暗條件下多喙莖點霉的分生孢子萌發(fā)率顯著低于全光照和光暗交替的條件（P＜0.05），孢子萌發(fā)率為32.0%；在全光照和光暗交替的條件下，多喙莖點霉的分生孢子萌發(fā)率無顯著差異，全光照下，多喙莖點霉的孢子萌發(fā)率較高，為39.3%（圖7）。

3 結論與討論

本試驗通過組織分離法對忍冬褐斑病葉片進行病原菌分離，并利用顯微技術對病原菌進行形態(tài)學鑒定，最終結合柯赫氏法則對病原菌進行驗證，結果將忍冬褐斑病病原菌鑒定為多喙莖點霉（Phoma multirostrata），莖點霉屬是半知菌亞門球殼孢目中的一個屬[18]；該屬真菌分布廣泛，寄主范圍廣[19]，對環(huán)境的適應性較強，可以使茄子、馬鈴薯、番茄等農(nóng)作物發(fā)生莖腐、枝枯、葉片和果實壞死，是一種分布較廣的病原菌[20-22]，嚴重影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和人民生活[22-24]。有文獻報道，上海和寧波檢疫局曾在進口的油菜、蘋果苗和大豆中檢疫出該菌[25-27]；另外，該病菌還會引起多花筋骨草黑脛病[28-29]。

國內(nèi)外對多喙莖點霉生物學研究較少，但針對莖點霉屬其他病原菌研究較多，雖所屬種不同，但在生物學方面存在相同之處，如引起苜蓿莖點霉葉斑病的苜蓿莖點霉（Phoma medicaginis）[30]和煙草莖點病的病原菌為廣生莖點霉（Phoma omnivirens）[31]。研究表明，適合這2種病原菌菌絲生長和孢子萌發(fā)的最適pH值為6，最適碳源均為蔗糖、葡萄糖和果糖，這與本研究的適合多喙莖點霉產(chǎn)孢的研究結果相似。本研究最適多喙莖點霉生長的氮源為硝酸鈉，而廣生莖點霉生長的最適氮源為硝酸鉀，硝酸鈉和硝酸鉀均屬于硝酸鹽。而對于光照的研究，2種病原菌與本研究的多喙莖點霉存在一定的差異，連續(xù)黑暗適合廣生莖點霉的生長，但苜蓿莖點霉的研究結果與本研究相同，全光照利于菌絲生長和產(chǎn)孢，這可能是由莖點霉屬之間不同種的差異或寄主的不同引起的。

另外，結合多喙莖點霉的侵染過程研究，應在秋天把病枝剪除，將落葉清理。在種植前，可以優(yōu)先選擇抗病品種，在種植過程中多注意修剪枝條，創(chuàng)造良好的通風條件，減少病害發(fā)生概率。種植時，選擇非寄主進行間作套種，避免該菌因寄主廣泛而導致交叉感染，進一步擴大危害甲基托布津、多菌靈和世高等能防治黑脛病、寡雄腐霉能有效抑制多喙莖點霉菌絲的生長[32-33]，可用于病害防治。

近些年，隨著忍冬市場需求急劇增大，很多地區(qū)開始大規(guī)模栽種忍冬，由于缺少科學的褐斑病病害防控措施，加之目前對忍冬褐斑病病原菌的研究甚少，造成植株減產(chǎn)，降低了種植戶的收益。本試驗的研究結果對忍冬褐斑病的鑒別和預防控制具有一定借鑒意義。