乳房外Paget病中RANKL、p-ERK1/2和p-mTOR表達(dá)的研究

李經(jīng)增,紀(jì)明開,林心瑜,張 良,蘇良寶

(1.三明市皮膚病醫(yī)院,福建 三明 365000;2.福建醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院,福建 福州 350000;3.廈門醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院,福建 廈門 361000;4.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院廈門醫(yī)院,福建 廈門 361000;5.泉州市安溪縣醫(yī)院,福建 泉州 362400)

乳房外Paget病(EMPD)是好發(fā)于頂泌汗腺數(shù)量較集中、非曝光區(qū)域的惡性皮膚腺癌，表現(xiàn)為不對稱擴(kuò)大的發(fā)展過程且特殊類型的異位性EMPD可累及口腔黏膜及口腔周圍、腋窩、下腹部等處。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)(免疫組化)檢測核因子受體激活因子κB配體(RANKL)，磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶-1/2(p-ERK1/2)，磷酸化哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)在EMPD中的表達(dá)，探討3條信號通路的生物學(xué)意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 80例確診為EMPD患者于2008-2017年在福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科及福建省皮膚性病防治院就診，其中男70例，發(fā)病年齡51～86歲，平均(64.48±8.19)歲；女10例，發(fā)病年齡51～73歲，平均(59.6±6.87)歲；發(fā)病至確診時(shí)間2～60個(gè)月，平均(28.8±3.6)個(gè)月。

1.2方法 采用免疫組化檢測患者標(biāo)本中RANKL，p-ERK1/2，p-mTOR的表達(dá)。

1.2.1試劑 使用北京博奧森生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的免疫組化試劑，實(shí)驗(yàn)步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行?？贵w稀釋比率均為1∶200。

1.2.2結(jié)果判定 選取5個(gè)高倍視野進(jìn)行陽性細(xì)胞平均百分比、染色強(qiáng)度評分。陽性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)比例小于5%計(jì)0分，5%～25%計(jì) 1分，>25%～50%計(jì)2分，>50%～75%計(jì)3分，>75%計(jì)4分。染色強(qiáng)度評分：細(xì)胞核無染色計(jì)0分，散在分布淺棕色或淺紅色計(jì)1分，彌漫分布棕色或紅色計(jì)2分，彌漫分布深棕色或深紅色計(jì)3分。依兩項(xiàng)之和判定：0分為陰性(-)，1～2分為弱陽性(+)，3～4分為陽性(++)，5分及以上為強(qiáng)陽性(+++)[1]。

2 結(jié) 果

2.1RANKL在EMPD中的表達(dá) RANKL定位于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核，陰性(-)14例，弱陽性(+)11例，陽性(++)23例，強(qiáng)陽性(+++)32例，見圖1。

2.2p-ERK1/2在EMPD中的表達(dá) p-ERK1/2定位于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核，陰性(-)11例，弱陽性(+)15例，陽性(++)18例，強(qiáng)陽性(+++)36例，見圖2。

A.鏡檢倍數(shù)：100×；B.鏡檢倍數(shù)：200×。

A.鏡檢倍數(shù)：100×；B.鏡檢倍數(shù)：200×。

2.3p-mTOR在EMPD中的表達(dá) p-mTOR定位于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核，陰性(-)9例，弱陽性(+)12例，陽性(++)18例，強(qiáng)陽性(+++)41例，見圖3。

A.鏡檢倍數(shù)：100×；B.鏡檢倍數(shù)：200×。

2.4RANKL與p-ERK1/2、p-mTOR的相關(guān)性 RANKL與p-ERK1/2、p-mTOR在EMPD中陽性表達(dá)呈正相關(guān)[相關(guān)系數(shù)(r)=0.907、0.931、0.998，P<0.05]，見表1。

表1 RANKL與p-ERK1/2、p-mTOR的相關(guān)性

3 討 論

RANKL主要由細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞外腫瘤壞死因子(TNF)家族同源區(qū)共同組成。當(dāng)RANKL識(shí)別到激活信號時(shí)，其可誘導(dǎo)受體發(fā)生構(gòu)象改變形成三聚體，與TNF適配蛋白形成復(fù)合體。RANKL與T細(xì)胞依賴性免疫反應(yīng)有關(guān)及在CD4+、CD8+中表達(dá)和T細(xì)胞的受體刺激是相一致的[2]，可耐受性誘導(dǎo)甚至還可能上調(diào)腫瘤細(xì)胞的抗凋亡通路，在多種癌細(xì)胞中均可表達(dá)與腫瘤病程相關(guān)[3]。本研究發(fā)現(xiàn)，EMPD腫瘤組織中RANKL表達(dá)的陽性率高達(dá)82.5%，提示腫瘤細(xì)胞通過RANKL這個(gè)媒介誘導(dǎo)其增殖分化，推測在疾病的初始階段正常組織細(xì)胞由于多種因素的影響下發(fā)生突變產(chǎn)生Paget細(xì)胞，繼而激活RANK-RANKL細(xì)胞信號通路，在此過程中RANKL通過調(diào)節(jié)朗格漢斯細(xì)胞和T細(xì)胞的亞群及M2巨噬細(xì)胞以自分泌或旁分泌的形式釋放多種多樣的炎癥細(xì)胞因子來誘導(dǎo)Paget細(xì)胞的增殖、遷徙或轉(zhuǎn)移，甚至進(jìn)一步發(fā)展突破真皮層或圍繞在附屬器周圍轉(zhuǎn)為侵襲性EMPD。另外，Paget細(xì)胞在上述炎癥因子、信號通路的多重激發(fā)下，通過腫瘤細(xì)胞自身的某些產(chǎn)物加強(qiáng)了RANKL的表達(dá)或通過級聯(lián)放大效應(yīng)促進(jìn)了免疫耐受、抑制性T細(xì)胞的免疫活化甚至介導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞表面異常免疫屏障等生物學(xué)行為來促使免疫抑制微環(huán)境的形成，讓Paget細(xì)胞逃避免疫監(jiān)測，擺脫了正常的細(xì)胞凋亡調(diào)控機(jī)制而呈特征性的跳躍式生長。

RAS-RAF-MEK-ERK簡稱為MAPK通路。ERK分為ERK1和ERK2，它們激活是通過MEK催化酪氨酸和蘇氨酸殘基的磷酸化來實(shí)現(xiàn)，它們發(fā)揮效應(yīng)后對細(xì)胞增殖和存活過程意義非常大。WANG等[4]發(fā)現(xiàn)ERK1/2促進(jìn)了胃癌的發(fā)生、發(fā)展，可以作為一個(gè)治療靶點(diǎn)的選擇。本研究發(fā)現(xiàn)80例EMPD中有69例呈陽性表達(dá)，其中強(qiáng)陽性(+++)有36例，這也提示ERK1/2參與了EMPD發(fā)生、發(fā)展過程。依研究結(jié)果推測ERK細(xì)胞信號通路促進(jìn)了Paget細(xì)胞的有絲分裂和激素受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，而且腫瘤細(xì)胞不間斷持續(xù)生長離不開細(xì)胞因子、血管淋巴管、營養(yǎng)物質(zhì)的支持，而ERK信號通路在發(fā)生作用的同時(shí)也離不開這些要素，Paget細(xì)胞在ERK的影響下加速了其增殖、轉(zhuǎn)移、跳躍式生長，部分發(fā)展到真皮成為侵襲性EMPD。

mTOR的主要特征是其具有調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、增殖和代謝[5]的作用并作為腫瘤治療的靶點(diǎn)受到了廣泛的關(guān)注[6]。mTOR的磷酸化要與相應(yīng)復(fù)合物結(jié)合，具有活性后[7]才能進(jìn)入負(fù)調(diào)控自噬[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，一方面，在結(jié)腸直腸癌中p-mTOR過表達(dá)可能參與疾病的發(fā)展，增加癌細(xì)胞蛋白分泌、縮短細(xì)胞周期，導(dǎo)致癌細(xì)胞的無限制增長[9]；另一方面，其還可能打亂正常細(xì)胞凋亡過程，增加異常細(xì)胞存活、血管增生[10]，如在乳腺癌中高表達(dá)對患者生存預(yù)后有著非常不利的影響[11]。p-mTOR信號軸還可能是促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖和侵襲的關(guān)鍵分子[12]。本研究中，p-mTOR的表達(dá)程度最高達(dá)71例，陽性率為88.75%，推測EMPD中Paget細(xì)胞生成后借助AKT協(xié)調(diào)腫瘤細(xì)胞有絲分裂信號，通過mTOR影響蛋白質(zhì)合成，在一定程度上是血管生成、延展的中樞調(diào)節(jié)因子，可能促進(jìn)了癌細(xì)胞蛋白的分泌。mTOR信號通路激活后讓突變而來的Paget細(xì)胞在G1、S期階段調(diào)控紊亂脫離正常細(xì)胞周期，促使其持續(xù)過度生長，可能與異常血管、淋巴增生及在瘤細(xì)胞凋亡、侵襲力、轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮了重要的作用。

通過計(jì)算RANKL、p-ERK1/2和p-mTOR三者在EMPD中陽性表達(dá)程度統(tǒng)計(jì)得出彼此之間呈正相關(guān)，這與以下學(xué)者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。張凌云等[13]對乳腺癌、JONES等[14]對骨轉(zhuǎn)移腫瘤均提出ERK參與了RANKL誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷徙和轉(zhuǎn)移。王妍等[15]采用流式技術(shù)表明惡性腫瘤中RANKL會(huì)激活A(yù)KT和ERK，同時(shí)借助以上3條信號通路來促使病情的變化與發(fā)展、增殖與轉(zhuǎn)移。據(jù)此可以推測RANKL在EMPD中通過了這2條信號通路激活p-ERK1/2、p-mTOR，促使其高表達(dá)，在一定程度上促進(jìn)了其信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)、表達(dá)，促使Paget細(xì)胞的生長、增殖，甚至侵襲和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，乳房外Paget病中RANKL、p-ERK1/2、p-mTOR的過度表達(dá)且呈正相關(guān)。提示相關(guān)信號通路在病程發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用，可能共同促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的生長、增殖和轉(zhuǎn)移，增加了疾病的侵襲性。