不同位置的滋養(yǎng)層細胞與內(nèi)細胞團分子核型的關(guān)系*

李成龍 ，葉洲杰，杜生榮,

（1.福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350117；2.福建省婦幼保健院 福建醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，福建 福州 350117）

近年來隨著科學(xué)技術(shù)在臨床應(yīng)用中的進步，越來越多的家庭，尤其是有家族遺傳病的夫妻開始選擇體外受精-胚胎移植技術(shù)（in vitro fertilization&embryo transfer，IVF-ET）來避免后代出現(xiàn)先天缺陷的遺傳病。隨著體外受精-胚胎移植技術(shù)的不斷發(fā)展，對于胚胎基因的分析及質(zhì)量的評估已經(jīng)成為胚胎移植前重要的篩選參考。然而目前大部分胚胎移植主要以卵裂球數(shù)目、形態(tài)、胞漿顆粒、碎片數(shù)量等為參考依據(jù)，單純的胚胎形態(tài)學(xué)評分只能從表觀上預(yù)測胚胎的發(fā)育潛能，無法檢測胚胎是否帶有異?；蚧蛉旧w病等。

據(jù)目前國內(nèi)的數(shù)據(jù)，輔助生殖臨床妊娠率為50%～60%之間，抱嬰率只有35%左右，而多數(shù)胚胎由于染色體異常導(dǎo)致早期妊娠丟失及流產(chǎn)。胚胎植入前遺傳學(xué)診斷（preimplantation genetic diagnosis，PGD）是目前對體外受精胚胎的染色體結(jié)構(gòu)和基因遺傳病檢測的常用方法，借助二代測序技術(shù)，從細胞分子水平檢測胚胎的核型，篩選出優(yōu)質(zhì)的胚胎進行移植，可以有效地提高抱嬰率。囊胚中主要有內(nèi)細胞團（inner cell mass，ICM）和滋養(yǎng)層細胞（tropheetoderm cell，TE）。目前，對處于囊胚期的胚胎進行囊胚活檢是最常用的方法，囊胚活檢主要是收集滋養(yǎng)層細胞，通過對滋養(yǎng)層細胞的基因及染色體分析來檢測胚胎是否正常，但是囊胚中的滋養(yǎng)層細胞的分布范圍較大，有的靠近內(nèi)細胞團稱為ICM鄰側(cè)細胞，有的遠離內(nèi)細胞團稱為ICM對側(cè)細胞，不同位置的滋養(yǎng)層細胞分子核型與內(nèi)細胞團有無相關(guān)性？是否會影響胚胎診斷結(jié)果？本研究通過對囊胚不同位置的滋養(yǎng)層細胞活檢后進行染色體分析，更深入地了解植入前胚胎嵌合的發(fā)生，并更精準地服務(wù)臨床。

1 對象和方法

1.1 對象

收集不適宜移植、評分差的囊胚，且夫妻雙方染色體均正常。此項研究患者知情同意并經(jīng)院倫理委員會同意。

1.2 方法

1.2.1 囊胚滋養(yǎng)層細胞和內(nèi)細胞團活檢

用激光在透明帶打個小孔，通過顯微操作系統(tǒng)，從不同位置活檢囊胚滋養(yǎng)層細胞和內(nèi)細胞團細胞，活檢后的細胞裝入PCR管，用于細胞全基因擴增。

1.2.2 細胞裂解

細胞裂解緩沖液（Cell Lysis Buffer）5 μL 與細胞裂解酶（Cell Lysis Enzyme）0.1 μL充分混勻，2.5 μL單細胞懸液加入其中，預(yù)熱PCR儀，孵育樣本。

孵育條件：50 ℃，50 min；80 ℃，10 min；4 ℃，長時間。

1.2.3 MALBAC預(yù)擴增

前擴增緩沖液（Pre-Amp Buffer）30 μL和前擴增酶（Pre-Amp Enzyme Mix）1 μL混合均勻，7.5 μL gDNA加入其中，短暫離心，充分混勻。

PCR 反應(yīng)條件：94 ℃，3 min，1個循環(huán)；20 ℃、40 s，30 ℃、40 s，40 ℃、30 s，50 ℃、30 s，60℃、30 s，70℃、4 min，95℃、20 s，58 ℃、10 s，8個循環(huán)；4 ℃、長時間。

1.2.4 MALBAC擴增

擴增緩沖液（Amplification Buffer）30 μL和擴增酶（Amp Enzyme Mix）0.8 μL混勻，向37.5μL DNA中加入30 μL MALBAC擴增混合液，離心混勻。

PCR 反應(yīng)條件：94 ℃、30 s，1個循環(huán)；94 ℃、20 s，58 ℃、30 s，72 ℃、3 min，20個循環(huán)；4 ℃，長時間。

采用Genomic DNA Clean&Concentrator試劑盒純化WGA產(chǎn)物，純化產(chǎn)物-20 ℃保存待用。

1.2.5 段化-連接反應(yīng)

x μL WGA產(chǎn)物(50 ng)，5X Buffer H 2 μL，Buffer EB( 7.6 μL-x μL)，F(xiàn)L-2酶0.4 μL，反應(yīng)體系共10 μL，孵育條件：55 ℃，10 min，孵育完畢后加入150 μL Buffer PB終止反應(yīng)，并加入20 μL Buffer EB至180 μL。

1.2.6 文庫擴增

擴增反應(yīng)體系：片段化-連接產(chǎn)物33.8 μL，5X KAPA2G Robust Buffer A 10 μL，2.5 mM dNTPs 4 μL，Index Primer Mix 2 μL，KAPA2G Robust DNA Polymerase 0.2 μL；擴增反應(yīng)條件：72 ℃ 3 min，1個循環(huán)；95 ℃ 2 min，1個循環(huán)；95 ℃ 30 s，62 ℃30 s，72 ℃ 3 min，14個循環(huán)；4 ℃，長時間。Qingen純化試劑盒純化PCR擴增產(chǎn)物。

1.2.7 測序數(shù)據(jù)分析

將細胞中提取后擴增的全基因送億康基因測序分析。

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)處理

采用spss25.0軟件處理數(shù)據(jù)。計數(shù)資料以例和百分數(shù)表示（%）。

2 結(jié)果

2.1 采樣細胞于滋養(yǎng)層細胞同側(cè)

體外受精的胚胎經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)后進入囊胚期，主要分為內(nèi)細胞團和滋養(yǎng)層細胞（圖1 A），用激光在透明帶區(qū)打個小洞，顯微操作儀在囊胚中不同部位分別吸取細胞，然后進行核型分析。根據(jù)分析結(jié)果（圖1 B，C）可知，滋養(yǎng)層細胞TE1和TE2與內(nèi)細胞團ICM測序結(jié)果一致，為46,XN。

圖1 人廢棄囊胚不同部位滋養(yǎng)層細胞（鄰ICM）測序結(jié)果

圖2人廢棄囊胚不同部位滋養(yǎng)層細胞（鄰ICM及對側(cè)）測序結(jié)果

2.2 采樣與滋養(yǎng)層細胞對側(cè)及鄰側(cè)

使用顯微操作儀對第二個囊胚上的不同部位吸取細胞（圖2 A），分析結(jié)果表明，TE2細胞的核型為46，XN -21(mos～30%)，而TE1、TE3以及ICM的核型結(jié)果一致為46,XN。

2.3 采樣與滋養(yǎng)層細胞隨機取

使用同樣的方法對第三個胚胎不同部位（圖3 A）進行檢測分析，分析結(jié)果（圖3 B）表明TE1的核型為46,XN,+16p(mos～40%)，其余細胞的核型與ICM一致為46,XN。

圖3 人廢棄囊胚多個位點滋養(yǎng)層細胞（鄰ICM及對側(cè)多處）測序結(jié)果

2.4 不同部位的滋養(yǎng)層細胞與內(nèi)細胞團基因水平的一致性匯總

對所有囊胚活檢細胞與對應(yīng)ICM細胞的檢測匯總發(fā)現(xiàn)，不同位置的滋養(yǎng)層細胞與內(nèi)細胞團的分子核型存在差異，ICM對側(cè)滋養(yǎng)層細胞20個中，有18個細胞分子核型與內(nèi)細胞團ICM一致，一致率為90%，而鄰側(cè)滋養(yǎng)層細胞28個中，有24個細胞與內(nèi)細胞團ICM一致，為86%?？梢?，滋養(yǎng)層細胞的分子核型不完全與內(nèi)細胞團一致。

表1 囊胚活檢細胞基因型與ICM比較

3 討論

受精卵發(fā)育成囊胚過程中，受精卵內(nèi)的細胞由于分布位置不同，分化成兩種細胞，一類是內(nèi)細胞團（Inner cell mass，ICM），未來發(fā)育成完整的個體；另一類是滋養(yǎng)層細胞（Tropheetoderm cell，TE），發(fā)育成胎盤。而胚胎植入前遺傳學(xué)診斷技術(shù)的應(yīng)用，是通過活檢滋養(yǎng)層細胞代替內(nèi)細胞團細胞來檢測胚胎染色體是否正常，從而減少對胎兒個體發(fā)育的干預(yù)。但是由于滋養(yǎng)層細胞存在染色體嵌合現(xiàn)象，判讀滋養(yǎng)層細胞異常核型或正常的核型與內(nèi)細胞團細胞實際的分子核型不相符，誤診率大約4.3%[1]。

如何降低誤診率的發(fā)生也是目前國際難解決的問題，本研究檢測囊胚滋養(yǎng)層細胞不同位置的分子核型，以期提高胚胎的準確診斷率?；顧z遠離內(nèi)細胞團或者靠近內(nèi)細胞團細胞，發(fā)現(xiàn)不同位置的分子核型有的與內(nèi)細胞團細胞不相符，有的相符，因此活檢滋養(yǎng)層細胞的位置不能間接提高內(nèi)細胞團分子核型的診斷準確性。Colls P等人研究卵裂期胚胎嵌合比率，至少兩個卵裂球是異常的，染色體的嵌合比率為30%[2]。而Capalbo A等人用FISH技術(shù)重新分析內(nèi)細胞團和滋養(yǎng)層細胞的分子核型，嵌合比率低于卵裂期[3]。因此可以通過卵裂期繼續(xù)培養(yǎng)囊胚來降低嵌合比率的發(fā)生，提高診斷的準確率。但是通過活檢不同位置的滋養(yǎng)層細胞，并不能提高囊胚診斷準確率，滋養(yǎng)層細胞分子核型是隨機分布的，靠近內(nèi)細胞團兩側(cè)細胞同樣有不同的分子核型。趙亮等人研究了人植入前囊胚滋養(yǎng)層細胞的空間表達，極滋養(yǎng)層細胞中306個基因上調(diào)而壁滋養(yǎng)層細胞只有75個基因上調(diào)，兩者基因表達存在差異性[4]。Munne S等人用FISH方法研究嵌合胚胎的發(fā)生機制，發(fā)現(xiàn)5%的非整倍體嵌合是由于有絲分裂后期延遲[5]。這意味著囊胚滋養(yǎng)層細胞就會出現(xiàn)正常的、單體型的、三體型的分子核型。根據(jù)Garrisi J等的分割實驗，嵌合體囊胚可以分割成不同的細胞系，即單體細胞系和三體細胞系[6]。由于滋養(yǎng)層細胞活檢是隨機的，不同位置的滋養(yǎng)層細胞分子核型與內(nèi)細胞團的分子核型沒有一致性，檢測結(jié)果不能反映胚胎的分子核型，但這樣的胚胎在臨床上仍有應(yīng)用價值。Bolton H等人以染色體嵌合老鼠為模型，發(fā)現(xiàn)非整倍體細胞通過凋亡模式消失，發(fā)育胎盤的細胞系有嚴重的增殖缺陷現(xiàn)象，但只要有充足的整倍體細胞，嵌合的胚胎仍然具有發(fā)育潛能[7]，2015年Greco E等人嘗試把無整倍體胚胎的18名患者，移植了嵌合比率為35%～50%的胚胎，結(jié)果誕生了6名染色體正常的嬰兒[8]，所以本研究認為滋養(yǎng)層細胞的分子核型并不能完全反應(yīng)內(nèi)細胞團的分子核型，滋養(yǎng)層沒有出現(xiàn)位置效應(yīng)，在臨床實踐中，如有嵌合型的胚胎，嵌合比率低，仍然建議移植，增加胚胎的利用率。很多醫(yī)院還會增加一項產(chǎn)前診斷的檢查，通過對羊水中胎兒脫落細胞的收集分析來進一步確定胎兒的發(fā)育情況以及基因是否正常。

目前胚胎植入前遺傳學(xué)診斷篩查技術(shù)的應(yīng)用，可以提高胚胎的種植率、妊娠率，但是對于假陰性和假陽性結(jié)果的出現(xiàn)還缺乏有效解決方法，本研究活檢不同位置的滋養(yǎng)層細胞，分子核型結(jié)果與內(nèi)細胞團比較未見相關(guān)性，因此無法通過篩選滋養(yǎng)層細胞的活檢位置，來提高胚胎分子核型診斷的準確性，仍然需要多中心、多個測序平臺來提高檢測的準確性，更好地服務(wù)不孕不育夫婦。