姜黃素通過抑制NF-κB信號通路減輕高糖致H9C2心肌細胞損傷的實驗研究*

夏娟 ，張書春 ，代紫陽 ，王亞

（1.唐山南湖醫(yī)院，唐山 063000；2.華北理工大學，唐山 063000）

高血糖通過加重炎癥反應和氧化應激程度在糖尿病心肌損害病理過程中起重要作用[1]。姜黃素是從中藥姜黃中提取的一種黃色酸性酚類物質，具有抗氧化、抗炎等作用，諸多研究表明姜黃素降低血糖、防治糖尿病并發(fā)癥的藥理作用明確[2-3]，同時對心血管有保護作用[4-5]。在前期動物實驗中發(fā)現姜黃素可以明顯減輕糖尿病大鼠心肌損傷程度，然而糖尿病心肌損傷病理過程復雜，姜黃素減輕高血糖致心肌細胞損害的作用機制仍需進一步探討。本研究以高糖誘導的H9C2心肌細胞損傷模型為研究對象，給予姜黃素干預，觀察姜黃素對心肌細胞的保護作用，并從炎癥反應指標腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6），氧化應激相關指標丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD），以及核轉錄因子κB（NF-κB）信號通路探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株 H9C2大鼠心肌細胞株購買于中國科學院上海生科院細胞資源中心。

1.2 用藥及試劑 姜黃素粉末（#C1386）、胰蛋白酶（#59429C）購自SIGMA公司；胎牛血清（#16000044）、低糖培養(yǎng)基（#12320032）、高糖培養(yǎng)基（#11965092）購自 GIBCO 公司；TNF-α（#H052）、IL-6（#H007）、乳酸脫氫酶（LDH）（#A020-2-2）、MDA（#A003-4-1）、SOD（#A001-3-2）酶聯免疫吸附（ELISA）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；兔抗大鼠第一抗體 IκB 激酶 β（IKKβ）（#8943S）、NF-κB（#8242S）、p-NF-κB（#3031S），小鼠抗大鼠第一抗體 GAPDH（#51332S）購自 Cell Signaling公司；MTT試劑盒（#ST316），BCA 蛋白濃度測定試劑盒（#P0012），辣根過氧化物酶標記山羊抗兔第二抗體IgG（#A0208）、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠第二抗體IgG（#A0216）購自碧云天生物技術研究所。

1.3 儀器 超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱（上海易亮醫(yī)療器械有限公司）；BS224S精密電子天平（SARTORIUS）；ST 16R高性能通用臺式冷凍離心機（美國 Thermo Scientific Sorvall）；M200PRO酶標儀（奧地利TECAN公司）；電泳儀，半干轉運系統，蛋白分析系統（BIO-RAD公司）。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) 給予10%FBS DMEM低糖培養(yǎng)基，置于細胞培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2）培養(yǎng)，待細胞約鋪滿培養(yǎng)皿底面積80%時進行傳代。

2.2 MTT法檢測細胞活性 對數生長期H9C2心肌細胞進行消化、重懸、計數后，接種于96孔細胞培養(yǎng)板（2 000個細胞/孔），培養(yǎng)48 h。吸原培養(yǎng)基，按照說明書加入100 μL新培養(yǎng)基及10 μL MTT溶液，將96孔板放置細胞培養(yǎng)箱內4 h。每孔加入二甲基亞砜（DMSO）150 μL，繼續(xù)置于細胞培養(yǎng)箱 15 min，使用酶標儀在波長570 nm測定吸光度OD值，根據說明書中的計算公式判斷細胞活性。

2.3 姜黃素配制 使用分析級天平稱取姜黃素粉劑，DMSO 溶解、配制成母液 1 mmol/L，0.22 μm 濾膜過濾除菌，-20℃避光保存。

2.4 高糖孵育建立心肌細胞損傷模型 根據文獻及本實驗的預實驗結果采用含有葡萄糖不同濃度的培養(yǎng)基（5.5、11.1、22.2、33.3、44.4 mmol/L）分別孵育H9C2心肌細胞12、24、48 h。由于在葡萄糖濃度33.3 mmol/L的培養(yǎng)基培養(yǎng)下H9C2心肌細胞隨著培養(yǎng)時間延長細胞存活率不斷下降且存活率趨近50%，因此選用高糖（33.3 mmol/L）培養(yǎng)基培養(yǎng)H9C2心肌細胞24 h建立心肌細胞損傷模型[6]。

2.5 分組及給藥 無血清低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞24 h，使細胞生長同步化后進行分組。實驗分為正常對照組、高糖對照組和姜黃素各劑量組（2.5、5、10、20 μmol/L）。正常對照組給予低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)；高糖對照組給予高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)；姜黃素各劑量組先給予相應劑量姜黃素預處理6 h，再給予高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)。

2.6 ELISA 法檢測 TNF-α、IL-6，MDA、SOD，LDH的含量 收集培養(yǎng)基作待測標本，按照試劑盒說明書進行操作，測定出細胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-6，LDH的含量水平；收集細胞，加入提取液后超聲波破碎細胞，離心取上清作為待測樣本，按照試劑盒說明書進行操作，測定出細胞中MDA、SOD的含量水平。實驗重復5次。

2.7 Western Blot檢測蛋白表達水平 吸棄各組培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，加入細胞裂解液，放置冰上裂解30 min后收集細胞，4℃，12 000 rpm離心15 min離心半徑10 cm。使用BCA法測定蛋白濃度。制備分離膠和濃縮膠，SDS-PAGE電泳分離各蛋白。半干法將蛋白轉移至PVDF膜上。封閉液封閉后，將PVDF膜放置于對應的一抗液中孵育，4℃過夜。洗膜后室溫孵育對應的第二抗體2 h。再次洗膜后，ECL顯色，暗室內曝光。利用Image J軟件計算蛋白條帶灰度值，目的蛋白條帶灰度值/內參蛋白條帶灰度表示相對蛋白表達水平。

3 結果

3.1 姜黃素對細胞活性的影響 MTT結果顯示，高糖對照組H9C2細胞活性較正常對照組明顯降低（P＜0.05）；姜黃素各劑量組H9C2細胞活性較高糖對照組均提高（P＜0.05）。姜黃素提高H9C2細胞活性的效果呈劑量依賴性，隨著姜黃素劑量的增加，H9C2細胞的活性越高，以姜黃素20 μmol/L劑量組細胞活性最高。見表1。

表1 姜黃素對H9C2細胞活性的影響（±s）

表1 姜黃素對H9C2細胞活性的影響（±s）

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與高糖對照組比較，#P<0.05。

組別 實驗次數 姜黃素含量（μmol/L） 存活率（%）正常對照組 6高糖對照組 6姜黃素組6 6 6 6-100.00-68.90±2.54*2.5 71.12±3.19 5.0 76.98±3.96#10.0 83.93±4.03#20.0 88.01±4.16#

3.2 姜黃素對TNF-α、IL-6和LDH含量的影響 與正常對照組比較，高糖對照組細胞培養(yǎng)液上清TNF-α、IL-6和 LDH 的含量均明顯增加（P＜0.05）；與高糖對照組比較，姜黃素各劑量組細胞培養(yǎng)液上清TNF-α、IL-6和 LDH 的含量均有所降低（P＜0.05），且降低效果呈姜黃素劑量依賴性，隨著姜黃素劑量的增加，上述指標含量降低越明顯，以姜黃素20μmol/L劑量組最為顯著。見表2。

表2 各組H9C2細胞培養(yǎng)液上清TNF-α、IL-6和LDH 的含量（±s）

表2 各組H9C2細胞培養(yǎng)液上清TNF-α、IL-6和LDH 的含量（±s）

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與高糖對照組比較，#P<0.05。

組別 實驗次數姜黃素含量（μmol/L）TNF-α（ng/L）IL-6（ng/L）LDH（μ/L）正常對照組高糖對照組姜黃素組6 6 6 6 6 6- 73.1±7.51 94.8±9.81 199.6±18.94- 148.2±12.03* 299.8±28.97* 291.0±23.63*2.5 129.1±12.27# 238.6±21.65# 274.5±20.07#5.0 115.4±10.98# 189.3±19.18# 260.6±21.23#10.0 96.5±10.12# 155.2±14.74# 248.3±20.29#20.0 90.1±10.21# 131.5±12.58# 229.2±20.91#

3.3 姜黃素對MDA和SOD含量的影響 與正常對照組比較，高糖對照組心肌細胞MDA含量明顯增加（P＜0.05），SOD 含量明顯降低（P＜0.05）；與高糖對照組比較，姜黃素各劑量組心肌細胞MDA含量均有所降低（P＜0.05），SOD含量均有所增加，且干預效果呈姜黃素劑量依賴性，隨著姜黃素劑量的增加，上述指標含量改變越明顯，以姜黃素20 μmol/L劑量組最為明顯。見表3。

表3 各組H9C2細胞中MDA和SOD的含量（±s）

表3 各組H9C2細胞中MDA和SOD的含量（±s）

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與高糖對照組比較，#P<0.05。

組別 實驗次數姜黃素含量（μmol/L）MDA（μmol/g）SOD（103μ/g）正常對照組 6高糖對照組 6姜黃素組6 6 6 6- 20.3±2.11 208.6±12.21- 30.7±3.96* 163.1±11.33*2.5 29.0±2.65 172.8±11.25 5.0 27.2±3.01# 180.0±12.24#10.0 26.1±2.17# 183.9±12.92#20.0 24.2±2.32# 198.3±13.22#

3.4 姜黃素對 IKKβ，NF-κB p65，p-NF-κB p65 蛋白表達的影響 與正常對照組比較，高糖對照組心肌細胞IKKβ、p-NF-κBp65蛋白表達明顯增加（P＜0.05），但 NF-κB p65蛋白表達無明顯變化（P＞0.05）；與高糖對照組比較，姜黃素各劑量組IKKβ、p-NF-κB p65蛋白表達明顯降低（P＜0.05），且蛋白表達的變化呈現姜黃素劑量依賴性，以姜黃素20 μmol/L劑量組最為明顯（P＜0.05）。見表4、圖1。

表4 姜黃素對IKKβ，NF-κB p65，p-NF-κB p65蛋白表達的影響（±s）

表4 姜黃素對IKKβ，NF-κB p65，p-NF-κB p65蛋白表達的影響（±s）

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與高糖對照組比較，#P<0.05。

組別 實驗次數姜黃素含量（μmol/L）IKKβ/GAPDH NF-κB p65/GAPDH p-NF-κB p65/GAPDH正常對照組高糖對照組姜黃素組6 6 6 6 6 6- 100.0 100.0 10.0±1.73- 361.2±30.82* 101.3±14.03▲ 59.6±6.01*2.5 232.8±25.91# 103.8±13.43▲ 50.3±5.92 5.0 208.9±21.67# 100.6±14.72▲ 38.1±4.15#10.0 151.5±17.05# 102.1±13.97▲ 34.8±3.95#20.0 131.1±14.98# 100.9±14.86▲ 30.4±3.01#

圖1 姜黃素對IR H9C2細胞IKKβ，NF-κB p65，p-NF-κB p65蛋白表達的影響

4 討論

糖尿病心肌損害的病理過程復雜[7]，是心肌細胞面對高血糖應激表現出來的病理改變。LDH是心肌細胞內的一種酶，細胞損傷時會被大量釋放出來。本實驗中高糖孵育H9C2心肌細胞24 h，細胞活力明顯下降，細胞培養(yǎng)液上清中LDH含量增加，提示心肌細胞存在損傷，成功建立高糖致心肌損傷模型。H9C2心肌細胞經過姜黃素預處理6 h，其活力明顯增強，釋放至細胞培養(yǎng)液上清中的LDH含量明顯降低，提示姜黃素可以保護心肌細胞，減輕高糖所致損傷。

炎癥反應是高糖致心肌損傷的重要機制[8]，眾多研究顯示在糖尿病心肌損傷相關動物、細胞模型中存在大量炎癥細胞因子如IL-6、TNF-α的分泌[9-10]，持續(xù)存在的炎癥反應最終導致心肌損傷。由于糖脂代謝紊亂，糖尿病機體的供能物質由葡萄糖轉為脂肪酸或酮體，心肌細胞耗氧增加，加之糖尿病機體微血管病變常見，造成心肌細胞處于缺氧狀態(tài)，低氧應激導致心肌組織TNF-α的分泌增多，進而啟動炎癥過程。此外，最新研究證實高血糖/高濃度葡萄糖在胞外與血清蛋白形成的糖基化終末產物（AGEs）可以直接結合細胞膜上的髓樣分化蛋白2，從而激活模式識別受體TLR4，形成的三者復合物激活炎癥信號通路[11]。氧化應激也是高糖致心肌損傷的一個重要因素[12]，心肌細胞是高耗能單元，線粒體是其能量代謝的中心，高血糖造成的低氧狀態(tài)使線粒體產生大量的活性氧（ROS），ROS直接損傷心肌細胞[13]。MDA和SOD是氧化應激系統中兩個重要的指標[14]，其中MDA反應脂質過氧化程度，其含量過高說明細胞受氧自由基損傷程度較嚴重，SOD含量直接反應細胞清除氧自由基的能力。本實驗中高糖對照組細胞培養(yǎng)液上清炎癥因子TNF-α、IL-6水平明顯升高，提示高糖致心肌損傷模型細胞存在炎癥反應過度；細胞內MDA含量增加、SOD含量降低，提示模型細胞存在過高的氧化應激水平。姜黃素預處理H9C2心肌細胞6 h可以明顯降低細胞培養(yǎng)液上清TNF-α、IL-6含量，降低細胞內MDA含量并增加SOD含量，說明姜黃素可以降低高糖致心肌損傷細胞模型的炎癥反應和氧化應激水平。

NF-κB是一種與炎癥反應和氧化應激密切相關的核轉錄因子[15]。當細胞受到多種因素刺激后，IκB 激酶復合體（IKK）激活 NF-κB[16]，后者轉移至細胞核內，與特定靶基因結合并調控靶基因轉錄，釋放IL-6、TNF-α等相關炎癥因子；并上調誘導型一氧化氮合酶的表達，增加過氧化物的形成。而TNF-α、IL-6等炎癥因子的釋放可反饋性作用于NF-κB；過氧化物可導致心肌中糖基化終末產物（AGEs）積累增多，而AGEs與其受體結合可以激活NF-κB，進而持續(xù)又不斷加重的炎癥反應和氧化應激狀態(tài)造成心肌損傷[18]。IKKβ是炎癥因子激活NF-κB所必需的IKK復合物活性亞基。NF-κB p65是NF-κB家族中的重要成員之一，可與NF-κB p50構成最為廣泛的異源二聚體，NF-κB p65磷酸化后從胞漿進入胞核，從而激活相關基因轉錄。本實驗中高糖致心肌損傷細胞模型中IKKβ蛋白表達增加，NF-κB磷酸活化水平加強，提示模型細胞內IKK/NF-κB通路過度激活。姜黃素預處理H9C2心肌細胞6 h可以明顯降低細胞IKKβ蛋白表達，下調NF-κB磷酸活化水平，抑制IKK/NF-κB信號通路過度激活。

綜上所述，高糖刺激誘導的持續(xù)且不斷加重的炎癥反應、氧化應激狀態(tài)以及IKK/NF-κB信號通路過度激活參與糖尿病心肌損傷的病理過程。姜黃素對糖尿病心肌損害具有較好的防治作用，其機制可能與抑制IKK/NF-κB通路的過度激活，繼而降低了炎癥反應水平及氧化應激程度有關。此外，本研究中各項異常指標的改善情況顯示姜黃素的干預作用具有劑量依賴性，隨著姜黃素劑量的增加，異常指標的改善越明顯，以姜黃素20 μmol/L劑量組最為顯著。