基于關(guān)聯(lián)分析的吳茱萸與8味甘味藥配伍作用規(guī)律研究*

李麗 ，孫立麗 ，任曉亮 ，劉亞男 ，竇志英 ，劉虹

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 301617）

吳茱萸始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，有小毒，為蕓香科植物吳茱萸Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.、石虎吳茱萸 Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.var officinalis（Dode）Huang或疏毛吳茱萸Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.var.bodinieri（Dode）Huang的干燥近成熟果實(shí)[1]。研究表明，吳茱萸具有良好的鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腫瘤等多種藥理學(xué)活性[2-4]。吳茱萸中含有生物堿類、苦味素類、揮發(fā)油類等多種化學(xué)成分，其中生物堿類成分是其主要有效成分[5-8]，發(fā)揮作用的同時(shí)，本身也具有一定的毒副作用。近年來，臨床上關(guān)于吳茱萸不良反應(yīng)的報(bào)道日益增多，蔡雪映[9]等曾報(bào)道過服用吳茱萸過量致死的個(gè)案，并在該患者血中檢測出了吳茱萸生物堿。Wen Bo[10]等通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，吳茱萸堿、吳茱萸次堿能夠抑制人肝微粒體CYP3A4，是肝毒性的潛在物質(zhì)。

鑒于對吳茱萸毒性的認(rèn)識(shí)，明代《景岳全書》曾記載“……然其性苦善降，若氣陷而元?dú)馓撜?，?dāng)以甘補(bǔ)諸藥制而用之”。故吳茱萸常與甘草、人參、大棗等配伍，以甘緩之，防氣虛氣陷[11]。本研究通過關(guān)聯(lián)規(guī)則分析，獲取常與吳茱萸配伍使用的甘味中藥，通過高效液相色譜法分析配伍過程中吳茱萸3種主要成分吳茱萸堿、吳茱萸次堿、檸檬苦素的含量變化，以期為吳茱萸配伍機(jī)制研究提供參考。

1 材料

Agilent 1260高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；Waters XSelect HSS T3色譜柱（美國Waters公司）；DV215CD十萬分之一天平（奧豪斯儀器有限公司）；FA2004萬分之一天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；Mili-Q Advantage A10超純水儀（美國Miliqore公司）；H2016D高速離心機(jī)（上海知信實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司）；KDM調(diào)溫電熱套（北京永興精佳儀器有限公司）。

吳茱萸（產(chǎn)地：江西），購自安國市興華中藥材有限公司，并經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)李天祥教授鑒定為蕓香科植物吳茱萸 Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.，本實(shí)驗(yàn)所使用的藥材為當(dāng)歸、甘草、炙甘草、生地黃、熟地黃、人參、茯苓、黃芪均購于北京同仁堂藥店；吳茱萸堿（批號(hào)：1222B024，≥98%）、吳茱萸次堿（批號(hào)：831A023，≥98%）購于北京索萊寶科技有限公司；檸檬苦素（批號(hào)：D1216AS，>98%）購于大連美侖生物技術(shù)有限公司。色譜級(jí)甲醇、乙腈購自美國Sigma公司，色譜級(jí)甲酸購于天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 基于關(guān)聯(lián)分析的吳茱萸藥對配伍規(guī)律研究

2.1.1 關(guān)聯(lián)分析 關(guān)聯(lián)分析是一種頻繁模式的數(shù)據(jù)挖掘分析方法，在中藥用藥規(guī)律分析中具有廣泛應(yīng)用[12-13]。Apriori算法是關(guān)聯(lián)分析中最經(jīng)典的原創(chuàng)性算法，通過逐層掃描計(jì)算、分類等步驟，從大量數(shù)據(jù)中分析尋找事務(wù)之間存在的潛在關(guān)聯(lián)和規(guī)律[14]，并以“X→Y”關(guān)系式的形式展示，X與Y分別稱為關(guān)聯(lián)規(guī)則的前項(xiàng)和后項(xiàng)[15]。

將《中華人民共和國藥典》2015版及部分古籍（包括傷寒論、金匱要略、婦人良方、千金方、景岳全書、太平惠民和劑局方、直指附遺方論、丹溪心法）中收載的含有吳茱萸的處方作為數(shù)據(jù)來源，并結(jié)合中藥方劑數(shù)據(jù)庫整理統(tǒng)計(jì)吳茱萸及其配伍的中藥，其中配伍藥物的生品和炮制品均分別使用生品名稱和炮制品名稱分開統(tǒng)計(jì)。以IBM SPSS Modeler 18.0作為分析軟件，采用Apriori算法以吳茱萸為關(guān)聯(lián)后項(xiàng)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。將最低條件支持度設(shè)置為10，最小規(guī)則置信度設(shè)置為95%，關(guān)聯(lián)得到21個(gè)吳茱萸藥對，如表1所示。表中21味中藥均可以與吳茱萸關(guān)聯(lián)為藥對配伍使用，經(jīng)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)上述藥物總頻次占所統(tǒng)計(jì)的配伍藥物（不包含吳茱萸）總頻次的37.82%。

表1 吳茱萸藥對關(guān)聯(lián)規(guī)則集

2.1.2 配伍藥物化學(xué)組分信息學(xué)挖掘分析 采用模糊聚類分析統(tǒng)計(jì)方法，對可與吳茱萸關(guān)聯(lián)為藥對的21味配伍中藥的組分類型進(jìn)行規(guī)律挖掘分析，以期從藥物組分水平對吳茱萸配伍規(guī)律進(jìn)行闡述。表2描述了配伍中藥的組分信息。依托SPSS Statistic 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，選用Euclidean Distance為測度，以Ward法為類間距離計(jì)算方法，采用層次聚類法對樣本進(jìn)行聚類分析，樹狀圖如圖1所示，當(dāng)以16為界限時(shí)，21味配伍中藥聚為2類，一類為甘味中藥（除白芍、醋延胡索之外），其主要成分為多糖、皂苷等；另一類為非甘味中藥?！案省睘橹兴幬逦吨?，具有能補(bǔ)、能緩、能和等功效，在中藥配伍中具有重要地位，基于聚類分析結(jié)果，本研究開展了當(dāng)歸、甘草、炙甘草、生地黃、熟地黃、人參、茯苓、黃芪8味甘味中藥在配伍過程中對吳茱萸的作用規(guī)律研究。

表2 配伍組分信息整理匯總表

圖1 配伍藥物聚類分析樹狀圖

2.2 8味甘味中藥在配伍過程中對吳茱萸的影響分析

2.2.1 供試品溶液的制備 單味藥供試品溶液的制備：稱取吳茱萸藥材約2 g，料液比為10，加水浸泡30 min后，回流提取1 h，過濾，4℃冰箱環(huán)境中靜置24 h，8 000 r/min離心15 min，沉淀物中加入2 mL乙醇并超聲20 min溶解，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

配伍藥對供試品溶液的制備：稱取吳茱萸藥材和甘味中藥各約2 g，料液比為10（另加甘味中藥的吸水量），浸泡30 min，加熱回流1 h，過濾，4℃冰箱環(huán)境中靜置24 h，8 000 r/min離心15 min，沉淀物中加入2 mL乙醇并超聲20 min溶解，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 對照品溶液的制備 分別取檸檬苦素、吳茱萸堿和吳茱萸次堿適量，精密稱定，置于容量瓶中，甲醇溶解，分別配置成濃度為0.94、1.12、0.46 mg/mL的對照品儲(chǔ)備液。

2.2.3 色譜條件 色譜柱：Waters XSelect? HSS T3（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）；等度洗脫：A：B=43：57；檢測波長：215 nm；柱溫：35 ℃；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；色譜圖見圖2。

圖2 吳茱萸及其配伍藥對高效液相色譜圖

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 分別稱取檸檬苦素、吳茱萸堿和吳茱萸次堿對照品適量，精密稱定，置容量瓶中，甲醇溶解定容，得到濃度分別為0.94、1.12、0.46 mg/mL的對照品儲(chǔ)備液。取對照品儲(chǔ)備液適量，用甲醇逐級(jí)稀釋成一系列不同濃度的對照品溶液。按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣分析。以對照品濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)（X）、峰面積（mAU×s）為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸分析，得到回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍。結(jié)果顯示檸檬苦素的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=2996.10X-34.27（r=0.999 8；0.094～0.0147 mg/mL）；吳茱萸堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=22 130.10X+318.11（r=0.999 6；1.12～0.008 7 mg/mL）；吳茱萸次堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線為 Y=21 922.53X-9.05（r=1；0.46～0.007 1 mg/mL），表明3種成分在其線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.2 精密度考察 取同一個(gè)吳茱萸樣本溶液按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6針，記錄色譜圖，計(jì)算成分峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積。檸檬苦素、吳茱萸堿和吳茱萸次堿的相對保留時(shí)間RSD值分別為0.00%、0.003%、0.004%；相對峰面積RSD值分別為0.00%、0.45%、0.29%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性考察 取同一個(gè)吳茱萸樣本，按“2.2.1”項(xiàng)下吳茱萸供試品溶液的制備方法平行制備6份吳茱萸溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件，檢測3種成分在提取物中的含有量，并計(jì)算RSD值。檸檬苦素、吳茱萸堿和吳茱萸次堿含有量的RSD值分別為2.33%、3.53%、3.06%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性考察 取同一個(gè)吳茱萸樣本，照“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件，分別與 0、2、4、8、12 和 24 h進(jìn)樣，記錄色譜圖，并計(jì)算成分峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積。檸檬苦素、吳茱萸堿和吳茱萸次堿的相對保留時(shí)間RSD值分別為0.00%、0.06%、0.12%；相對峰面積RSD值分別為0.00%、1.68%、1.62%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 分別稱取6份吳茱萸樣品各約2 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，分別加入一定量的對照品，按照“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液進(jìn)行檢測并計(jì)算各成分的加樣回收率。檸檬苦素、吳茱萸堿和吳茱萸次堿的平均回收率±SD（RSD）分別為 101.31%±0.03%（2.74%）、99.60%±0.03%（2.60%）、102.50%±0.01%（0.61%），表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.4 提取物中含量檢測結(jié)果 檢測了與甘味中藥配伍前后吳茱萸中檸檬苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿3種化學(xué)成分在提取物中含量的變化，結(jié)果見表3。方差分析結(jié)果P<0.05，各組數(shù)據(jù)之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。由表3得到3種成分平均含量比例轉(zhuǎn)換表，并繪制雷達(dá)圖，見表4和圖3。結(jié)果顯示，在配伍過程中，8味甘味中藥可不同程度地降低檸檬苦素、吳茱萸堿和吳茱萸次堿3種主要成分在提取物中的含量。其中，黃芪使3種有效成分的含量明顯下降；甘草較大程度地降低了吳茱萸堿和吳茱萸次堿的含量，但對檸檬苦素的作用較小。

表3 吳茱萸配伍前后3種成分平均含量統(tǒng)計(jì)表（±s）mg/g

表3 吳茱萸配伍前后3種成分平均含量統(tǒng)計(jì)表（±s）mg/g

注：均與吳茱萸單煎液相比，*P<0.05，**P<0.01。

樣品 n 檸檬苦素 吳茱萸堿 吳茱萸次堿吳茱萸單煎液 9 17.61±0.67 9.03±0.52 1.61±0.05吳茱萸-人參藥對 9 17.48±1.51 8.62±0.24 1.59±0.11吳茱萸-生地黃藥對 9 14.56±0.61** 8.69±0.62 1.54±0.05吳茱萸-熟地黃藥對 9 15.44±2.62* 8.32±0.46 1.17±0.17**吳茱萸-茯苓藥對 9 17.01±0.58 8.28±0.67 1.35±0.07**吳茱萸-當(dāng)歸藥對 9 16.95±1.43 7.55±1.15**1.36±0.18**吳茱萸-炙甘草藥對 9 15.59±1.52* 6.75±0.19**1.47±0.09吳茱萸-甘草藥對 9 15.37±0.30* 6.57±0.37**1.17±0.04**吳茱萸-黃芪藥對 9 12.74±1.11** 6.23±0.92**0.94±0.06**

表4 吳茱萸配伍前后3種成分平均含量比例轉(zhuǎn)換表

圖3 吳茱萸單煎液及藥對3種成分平均含量雷達(dá)圖

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過關(guān)聯(lián)分析和聚類分析結(jié)合含量測定，探討吳茱萸與甘味中藥配伍前后吳茱萸中3種主要成分檸檬苦素、吳茱萸堿和吳茱萸次堿在提取物中含量的變化。結(jié)果顯示，8種甘味中藥均可不同程度的降低吳茱萸提取物中3種主要成分的含量；黃芪使提取物3種有效成分的含量明顯下降，甘草可明顯地降低提取物中吳茱萸堿和吳茱萸次堿的含量但對檸檬苦素的作用較小。

《素問·藏氣法時(shí)論》記載：“肝苦急，急食甘以緩之；脾欲緩，急食甘以緩之，用苦瀉之，甘補(bǔ)之”，甘味藥具有緩急、佐制的作用，可緩和藥物峻烈之性，緩解藥物毒性?！侗静菡x》也提出“解毒者，甘為土之正味，凡毒得土則化，故大甘之味可以解毒”[44-45]。研究發(fā)現(xiàn)，甘味藥中帶有多個(gè)極性基團(tuán)，能與復(fù)方中其他藥物的相關(guān)基團(tuán)發(fā)生氫鍵鍵合、絡(luò)合與締合，共價(jià)鍵縮合，形成更大的超分子集團(tuán)，使這些藥物的特性基團(tuán)結(jié)構(gòu)形態(tài)發(fā)生改變，到達(dá)病灶后通過緩慢分解，放出有效的功能基與病灶作用，進(jìn)而降低與病灶作用的強(qiáng)度，或者抑制其副作用，或使藥物療效保持更長的時(shí)間。吳茱萸中含有大量的生物堿，可與甘味藥中的極性基團(tuán)結(jié)合形成糖苷，以降低生物堿的毒性[46]。