金沸草HS-GC-MS指紋圖譜研究*

王珊珊，周蕊，李晉，何俊，常艷旭

（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 301617）

金沸草為菊科植物條葉旋覆花Inula linariifolia Turcz.或旋覆花Inula japonica Thunb.的干燥地上部分[1]，具有降氣、消痰、行水之功效[2]。文獻(xiàn)報(bào)道，金沸草主要含有萜類(lèi)和黃酮苷類(lèi)化合物，具有抗炎、抗真菌、抗腫瘤等藥理作用[3-5]。倍半萜內(nèi)酯類(lèi)是其特征性成分，研究表明金沸草含有ivangustin、澤蘭內(nèi)酯、1-乙酰氧基大花旋覆花內(nèi)酯等倍半萜類(lèi)成分[6-8]。有學(xué)者采用HPLC方法測(cè)定了金沸草中五個(gè)倍半萜類(lèi)成分的含量，其中1-乙酰氧基大花旋覆花內(nèi)酯含量較高且具有抗炎藥理活性[9-10]。金沸草在中醫(yī)臨床上多用于治療瘡瘍、咳嗽等疾病[11-12]。目前，金沸草頭狀花序研究較多，已采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）開(kāi)展了揮發(fā)油定性研究[13-14]，但有關(guān)的金沸草地上全草的揮發(fā)性成分的研究未見(jiàn)報(bào)道。本文對(duì)來(lái)自不同產(chǎn)地、不同批次金沸草的揮發(fā)油進(jìn)行系統(tǒng)研究，以期對(duì)金沸草的藥材品質(zhì)進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)。

靜態(tài)頂空分析（HS）屬于頂空進(jìn)樣方式的其中一種，操作簡(jiǎn)便且無(wú)需有機(jī)溶劑的參與，通過(guò)與色譜儀聯(lián)用可實(shí)現(xiàn)對(duì)揮發(fā)性成分的定性和定量分析[15]。GC-MS能夠高效靈敏的識(shí)別和分析復(fù)雜的化學(xué)成分[16]。頂空分析與氣相質(zhì)譜技術(shù)（HS-GC-MS）聯(lián)用技術(shù)已經(jīng)在食品、環(huán)境和生物樣品檢測(cè)等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[17-19]。中藥指紋圖譜技術(shù)是在整體上對(duì)中藥材進(jìn)行綜合和量化的客觀分析，從而評(píng)價(jià)中藥材的真?zhèn)蝺?yōu)劣及穩(wěn)定性[20]。本文采用HS-GC-MS聯(lián)用技術(shù)對(duì)不同產(chǎn)地、不同批次的金沸草藥材的揮發(fā)性成分進(jìn)行研究，建立揮發(fā)性成分的指紋圖譜體系并確定其共有峰成分，為金沸草的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范的制定及藥效物質(zhì)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備 金沸草藥材分別購(gòu)自于安徽、貴陽(yáng)、河北等地，樣品產(chǎn)地詳情見(jiàn)表1，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)常艷旭研究員鑒定其均為菊科植物旋覆花（Inula japonica Thunb.）。

表1 22批金沸草的產(chǎn)地來(lái)源

GC-MS為日本島津GC-MC QP2010，頂空進(jìn)樣器意大利DANI HSS 68.50（意大利丹尼），DB-5MS（0.25 mm，0.25 μm，30 m）彈性石英毛細(xì)管柱。

1.2 供試品的制備 取適量金沸草飲片粉碎，過(guò)50目篩，精密稱(chēng)量樣品2.00 g置于頂空進(jìn)樣瓶中，并立即封口。

1.3 HS-GC-MS分析條件 靜態(tài)頂空條件：進(jìn)樣器加熱爐爐溫100℃，進(jìn)樣系統(tǒng)溫度120℃，傳輸管線(xiàn)溫度140℃，加熱時(shí)間為30 min。

氣相色譜條件：初始溫度50℃保持1 min，以5℃/min速率升溫至225℃后以15℃/min速率上升至250℃。進(jìn)樣口溫度為250℃，線(xiàn)速度控制流量，柱流量為1.2 min/mL，分流模式，分流比為5。

質(zhì)譜條件：接口溫度280℃，離子源溫度230℃，溶劑延遲時(shí)間1min，全掃描SCAN模式，間隔時(shí)間為0.3 s，掃描范圍40～600 m/z，檢測(cè)器電壓為1.3 kV。

2 結(jié)果與討論

2.1 金沸草揮發(fā)性成分定性分析 采用HS-GCMS技術(shù)檢測(cè)金沸草藥材中的揮發(fā)性成分，其氣相質(zhì)譜總離子流圖（TIC）如圖1所示，各色譜峰表明金沸草藥材中含有的揮發(fā)性成分復(fù)雜多樣。參照NIST08質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)金沸草TIC圖進(jìn)行相似度檢索，篩選出匹配率不低于80%的色譜峰，最終定性出104種化學(xué)成分，并采用峰面積歸一化算法計(jì)算各揮發(fā)性成分的相對(duì)百分含量，見(jiàn)開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼表2。發(fā)現(xiàn)金沸草藥材含有的揮發(fā)性成分主要包括萜類(lèi)、醛類(lèi)兩大類(lèi)成分。其中萜類(lèi)化合物有43種，相對(duì)含量為22.4%，包括萜烯24種（12.22%）、萜醇 11種（3.88%）、萜酮 6種（4.58%），萜醛3種（1.72%），其中以萜烯成分為主；醛類(lèi)化合物有12種，其相對(duì)含量最高且占所檢測(cè)揮發(fā)性成分的42.01%，以2-甲基丁醛為主。除此之外，還含有醇類(lèi)8種（5.92%）、芳香族化合物7種（3.75%）、烷烴類(lèi)6種（5.08%）、烯酮類(lèi)10種（4.76%）、呋喃類(lèi)5種（8.18%）、有機(jī)酸5種（4.93%）、酯類(lèi)4種（2.17%）、其他類(lèi)3種（0.8%）。

圖1 金沸草HS-GC-MS總離子流圖

由于地理位置、生長(zhǎng)環(huán)境等因素，不同產(chǎn)地間金沸草的揮發(fā)性成分含量存在明顯差異。由圖2所示，十類(lèi)不同產(chǎn)地的樣品中化合物均以萜、醛類(lèi)為主，其中醛類(lèi)成分在湖南（S18）產(chǎn)地相對(duì)含量最高，江蘇產(chǎn)地最低。萜類(lèi)成分在河南產(chǎn)地與安徽產(chǎn)地的相對(duì)含量相近，比例較高。酯類(lèi)成分在四川（S21）產(chǎn)地中相對(duì)含量較好。醇類(lèi)化合物在江蘇（S19）產(chǎn)地中所占比例較高。其余化合物在不同產(chǎn)地間的相對(duì)含量差異性較小。安徽（S1-S5）產(chǎn)地的五個(gè)不同批次間萜類(lèi)與醛類(lèi)的相對(duì)含量差異較大，這可能是由于陽(yáng)光、土壤、水分等多種環(huán)境因素導(dǎo)致的。貴陽(yáng)（S8-S10）、河南（S11-S16）的批間差異性較小，各類(lèi)成分的相對(duì)含量相近。因此，萜類(lèi)、醛類(lèi)和醇類(lèi)成分是不同產(chǎn)地、不同批次的金沸草揮發(fā)油質(zhì)量的差異成分。

圖2 不同產(chǎn)地金沸草中各類(lèi)成分相對(duì)含量分布圖

2.2 金沸草指紋圖譜分析

2.2.1 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1.1 精密度實(shí)驗(yàn) 精確稱(chēng)量2.00 g樣品，在“1.3”項(xiàng)條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得共有峰的峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于4.4%，證明儀器精密度良好。

2.2.1.2 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 精確稱(chēng)量6份樣品，在“1.3”項(xiàng)條件下平行操作6次，測(cè)得共有峰的峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于4.0%，證明方法重現(xiàn)性良好。

2.2.1.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精確稱(chēng)量6份樣品，在“1.3”項(xiàng)條件下，分別在 0、2、4、8、12 和 24 h 進(jìn)樣分析，測(cè)得共有峰的峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于4.6%，證明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定，結(jié)果可靠。

2.2.2 金沸草指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià) 收集的22批藥材在“1.3”項(xiàng)條件下進(jìn)行HS-GC-MS分析，將各批樣品的GC-MS數(shù)據(jù)導(dǎo)入到“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012版”軟件，以S12譜圖為參照生成標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜（R）如圖3所示。

圖3 金沸草HS-GC-MS指紋圖譜

GC-MS圖譜結(jié)果顯示22批金沸草藥材指紋圖譜既在整體上具有相似性，又有各自的特征性，表明不同產(chǎn)地、同一產(chǎn)地不同批次的金沸草藥材含有的化學(xué)成分有所差異。應(yīng)用夾角余弦計(jì)算方法，評(píng)價(jià)22批金沸草的圖譜相似度，計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表3。除了兩批相似度為0.835和0.848，其余相似度均在0.945以上。上述研究結(jié)果表明，所建立的金沸草藥材HS-GC-MS指紋圖譜準(zhǔn)確可靠，可為金沸草的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供技術(shù)支撐。

表3 22批金沸草藥材相似度

2.3 金沸草共有峰分析 根據(jù)指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)對(duì)22批藥材色譜圖的分析，通過(guò)比對(duì)保留時(shí)間是否一致，以及選擇經(jīng)NIST08數(shù)據(jù)庫(kù)分析匹配度不低于85%且峰響應(yīng)值較高的峰作為依據(jù)，共指認(rèn)出13個(gè)共有峰，經(jīng)NIST08數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)共有峰定性分析的結(jié)果見(jiàn)表4。22批藥材共有的揮發(fā)性成分主要為萜類(lèi)、醛類(lèi)、呋喃類(lèi)及醇類(lèi)等成分。萜類(lèi)成分有4種，其中包括3種萜醇和1種萜烯，分別為桉葉油醇、（+/-）-薄荷醇、（-）-4-萜品醇、蒎烯；醛類(lèi)成分有3種，分別為苯甲醛、正辛醛和癸醛。另外還含有2種呋喃（2-乙基呋喃、2-正戊基呋喃），2種醇類(lèi)（正己醇、2.6-二甲基環(huán)己醇），1種烯酮（甲基庚烯酮）及1種芳香族化合物（鄰異丙基甲苯）。

表4 共有峰的定性分析

4 結(jié)論

金沸草為傳統(tǒng)中藥材，具有降逆的中藥特性，在臨床上發(fā)揮著不可或缺的位置。但其化學(xué)成分復(fù)雜，種類(lèi)繁多，揮發(fā)油產(chǎn)物仍然模糊，質(zhì)量評(píng)價(jià)體系還不完善。本研究采用HS-GC-MS分析技術(shù)，構(gòu)建了金沸草揮發(fā)性化學(xué)成分指紋圖譜，定性出104種化學(xué)成分，包括萜類(lèi)、醛類(lèi)、烯酮、醇類(lèi)、有機(jī)酸及呋喃類(lèi)等，其中萜類(lèi)和醛類(lèi)是其主要揮發(fā)性成分。22批藥材經(jīng)GC-MS分析指認(rèn)出13個(gè)共有峰，包括萜類(lèi)、醛類(lèi)、醇類(lèi)及呋喃類(lèi)等，其中含有3種萜醇和1種萜烯。萜類(lèi)化合物普遍具有抗炎、抑菌等藥理作用[21]。桉葉油醇能夠選擇性地調(diào)節(jié)PRR信號(hào)通路，下調(diào)炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6等表達(dá)而表現(xiàn)抗炎活性，同時(shí)它可通過(guò)減少神經(jīng)元凋亡、小膠質(zhì)細(xì)胞激活和氧化應(yīng)激發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[22-23]。薄荷醇通過(guò)MAPK、NF-κB和AKT信號(hào)通路抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)[24]。（-）-4-萜品醇抑制 p38MAPK/NF-κB（p65）信號(hào)通路，從而改善小鼠變應(yīng)性鼻炎和哮喘綜合征[25]。蒎烯能夠干擾微生物的發(fā)育和繁殖，具有明確的抗菌特性[26]?；谶@些化學(xué)成分的抗炎、抗菌的藥理活性，推測(cè)其可能與金沸草發(fā)揮“降氣、消痰、行水”的藥效作用有著密切聯(lián)系。因此，文章建立了金沸草HS-GC-MS指紋圖譜，方法學(xué)考察表明該指紋圖譜穩(wěn)定、準(zhǔn)確、可靠。本研究反映了金沸草藥材的揮發(fā)性成分的種類(lèi)與數(shù)量，為金沸草藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供技術(shù)。