兒童Rotor綜合征臨床特點及SLCO1B1和SLCO1B3基因突變分析

葉家衛(wèi) 譚麗梅 楊峰霞 徐 翼 李旭芳

廣州市婦女兒童醫(yī)療中心感染性疾病科(廣州 510120)

Rotor綜合征(Rotor syndrome，RS，MIM #237450)，是一種遺傳性非溶血性高膽紅素血癥，臨床上較為罕見，最先于1948年由Rotor報道, 屬于常染色體隱性遺傳性疾病[1]，其主要臨床特征是可為慢性持續(xù)性或間歇性黃疸，有時鞏膜黃疸可能為唯一的臨床表現(xiàn)，血清結(jié)合膽紅素輕度升高，也可伴有間接膽紅素的升高。近年來由于基因檢測技術(shù)的進步，越來越多兒科患兒得以早期明確診斷。本文通過2018年—2019年廣州市婦女兒童醫(yī)療中心經(jīng)基因檢測確診的3例RS患者，探討該病臨床及基因變異特征。

1 資料與方法

1.1 病例資料

例1，女，5歲11月。因“鞏膜黃染1月余”就診。大便黃色，小便色黃清亮。未予特殊治療。足月順產(chǎn)，生后無明顯皮膚黃染消退延遲等情況，其兄長健康，無家族史。查體：神志清，精神好，鞏膜略黃染，皮膚無明顯黃染。腹軟，肝肋下2 cm，質(zhì)軟，脾未及。外院檢查肝炎全套、銅藍蛋白、自身免疫性肝炎抗體、血漿氨基酸、血?；鈮A及尿液GC/MS均正常，EB病毒抗體及G-6-PD陰性。我院檢查：HGB 122 g/L，Ret 0.12%，ALT 12 U/L，AST 30 U/L，ALP 295 U/L，GGT 9 U/L，TBIL 47.5 μmol/L，DBIL 34.8 μmol/L，IBIL 12.7 μmol/L，TBA 9.8 μmol/L，腹部B超肝脾不大。

例2，男，3歲4月。因“反復皮膚鞏膜黃染3年余”就診?；純撼錾髷?shù)天出現(xiàn)皮膚鞏膜黃染，排3天墨綠色胎便后轉(zhuǎn)為淡黃色大便，小便色黃色清亮。當?shù)蒯t(yī)院予藍光照射治療后皮膚鞏膜黃染明顯減輕，大便轉(zhuǎn)為黃色后出院。其后仍有皮膚鞏膜輕度黃染，但未再診治。10月齡感冒當?shù)剌斠?用藥不詳)治療后皮膚鞏膜黃染較前明顯，當?shù)蒯t(yī)院就診檢查ALT 9.05 U/L，AST 26.45 U/L，TBIL 82.99 μmol/L，DBIL 50.64 μmol/L，IBIL 32.35 μmol/L，血氨正常，予優(yōu)思弗、消炎利膽片治療后，皮膚鞏膜黃染較前減輕。其后仍有反復，皮膚鞏膜黃染一直未完全消退。感冒時有加重，間斷口服中藥退黃治療。其兄長體健，無家族史。查體：神志清，精神好，皮膚鞏膜輕度黃染，腹軟，肝脾未及。我院檢查：HGB 123 g/L，Ret 0.15%，ALT 9 U/L，AST 30 U/L，ALP 286 U/L，GGT 10 U/L，TBIL 47.6 μmol/L，DBIL 32.0 μmol/L，IBIL 15.6 μmol/L，TBA 3.5 μmol/L。肝炎全套、輸血前四項、EBV抗體陰性。G-6-PD正常。腹部B超未見明顯異常。

例3，男，2月。因“反復皮膚鞏膜黃染2月”就診?；純荷?周出現(xiàn)皮膚黃染，曾服用茵梔黃，黃疸反復，大便黃色，否認解陶土色大便，小便黃色。父親乙肝攜帶者，無家族史。查體：神清，精神好，皮膚鞏膜輕度黃染，腹平軟，肝肋下2 cm，質(zhì)軟，脾肋下未及。外院檢查：乙肝陰性，G-6-PD正常，腹部B超未見異常。我院檢查：HGB 130 g/L，Ret 0.32%，ALT 21 U/L，AST 41 U/L，ALP 385 U/L，GGT 11 U/L，TBIL 51.8 μmol/L，DBIL 36.7 μmol/L，IBIL 15.1 μmol/L，TBA 9.5 μmol/L，CMV抗體、CMV-DNA定量陰性、血漿氨基酸、血酰基肉堿及尿液GC/MS均正常。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 例1、例2采集患兒及其父母兄長，例3采集患兒及其父母外周靜脈血2 mL，應(yīng)用TIANamp Genomic DNA提取試劑盒(北京)提取DNA，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.2.2 常見肝臟遺傳代謝性疾病二代測序篩查 委托武漢康圣達醫(yī)學檢驗所進行常見已知肝臟單基因遺傳性疾病二代測序篩查。

1.2.3 一代測序驗證與DNA瓊脂糖凝膠電泳鑒定通過Illumina HiSeq平臺對患兒基因組進行全外顯子測序，采用IDT xGen Exome Research Panel v1.0試劑盒，Kappa文庫構(gòu)建試劑盒，外顯子組測序目標區(qū)域平均測序深度大于100 ，目標序列的95%測序深度達20 。使用基因檢測智能操作系統(tǒng)進行注釋，SNPEFF軟件(hg19，GRCh37)進行變異解讀。在需要進行大片段突變鑒定時，采用DNA瓊脂糖凝膠電泳分析。

2 結(jié) 果

2.1 二代測序結(jié)果

3例患兒均在染色體位置chr12:21375289處SLCO1B1基因出現(xiàn)c.1738C>T純合突變(見圖1)；均在SLCO1B3基因5號內(nèi)含子區(qū)域存在大片段插入純合突變(6.1-kbp L1 retrotransposon in intron 5)。

2.2 一代測序驗證

對SLCO1B1基因突變位點進行家系驗證，例1患兒父親、母親為雜合突變，兄長為野生型；例2患兒父親、母親、兄長均為雜合突變；例3患兒父親、母親均為雜合突變(見圖1)。

圖1 例1(A)、例2(B)、例3(C)患兒SLCO1B1基因突變位點測序圖

2.3 DNA瓊脂糖凝膠電泳進行大片段突變鑒定

為鑒定SLCO1B3基因的5號內(nèi)含子區(qū)域的大片段插入突變，在突變體的插入片段前端設(shè)計引物F為“TCAATGGAACATCACCTGAGA”、在插入片段上設(shè)計引物R1為“CCGTTTCTTAAGCCGGTCTG”、在插入片段后設(shè)計引物R2為“GTGGTGGGTTTCTCCTTCTG”，位置見圖2，其中A為突變體、B為野生型。根據(jù)DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果是否存在條帶以及擴增序列大小的情況來判斷突變類型。結(jié)果提示SLCO1B3基因5號內(nèi)含子區(qū)域大片段插入突變例1患兒父親、母親為雜合突變，兄長為野生型；例2患兒父親、母親、兄長均為雜合突變；例3患兒父親、母親均為雜合突變(見圖3)。

圖2 引物設(shè)計示意圖

圖3 SLCO1B3基因5號內(nèi)含子區(qū)域存在大片段插入突變

2.4 診斷

根據(jù)3例患兒臨床主要表現(xiàn)為鞏膜和(或)皮膚黃染，實驗室檢查示以高直接膽紅素血癥為主，或伴間接膽紅素增高，肝功能轉(zhuǎn)氨酶正常，γ谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶和堿性磷酸酶及膽汁酸水平正常，血色素、網(wǎng)織紅細胞未見異常，無膽道梗阻征象，考慮高結(jié)合膽紅素血癥。根據(jù)SLC01B1和 SLC01B3雙基因純合突變結(jié)果，確診為Rotor綜合征。

3 討 論

肝臟是膽紅素代謝的唯一器官。以往我們所認知的肝臟清除膽紅素的過程包括四個主要步驟:肝細胞攝取和儲存未結(jié)合膽紅素；未結(jié)合膽紅素與葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶在滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合轉(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)合膽紅素；結(jié)合膽紅素排泄入膽汁;肝細胞再攝取結(jié)合膽紅素[1]。近幾十年來，對膽紅素代謝的理解已經(jīng)隨著膽汁中內(nèi)源性和外源性陰離子底物的消除過程而得以擴展[2]。結(jié)合膽紅素排泄入膽汁的過程中，其中一部分可向肝細胞膽小管面彌散，另一部分向肝細胞血竇面彌散。在肝細胞膽小管面，結(jié)合膽紅素可通過ABCC2/MRP2和ABCG2/BCRP轉(zhuǎn)運蛋白被有效分泌入膽汁[3]。而彌散至肝細胞血竇膜面的結(jié)合膽紅素由MRP3蛋白轉(zhuǎn)運分泌入血液，隨后可再被竇膜上結(jié)合的有機陰離子轉(zhuǎn)運蛋白OATP1B1和OATP1B3攝入肝細胞[1]。

近年來的研究認為位于12號染色體上的相鄰基因SLCO1B1和SLCO1B3均存在純合或復合雜合突變且其編碼的OATP1B1和OATP1B3蛋白同時完全缺失是RS發(fā)生的分子機制，為常染色體雙基因隱性突變的遺傳性疾病[4]。OATP1B1和OATP1B3均在肝細胞膜表達，為溶質(zhì)載體超家族有機陰離子轉(zhuǎn)運多肽，主要介導血液中各種內(nèi)源性和外源性化合物在肝細胞的吸收[3]。膽紅素是SLCO1B1/OATP1B1和SLCO1B3/OATP1B3的底物[5]。RS患者的肝組織免疫組化染色進一步證實OATP1B1和OATP1B3兩種轉(zhuǎn)運蛋白均完全缺失，而單一等位基因上表達的SLCO1B1或SLCO1B3均不會出現(xiàn)黃疸。這種雙基因同時突變使得肝細胞對血液中的結(jié)合膽紅素的再攝取出現(xiàn)障礙[6]，且OATP1B1和OATP1B3蛋白的表達在位于中央靜脈附近的肝細胞較門管區(qū)附近肝細胞中更高，可能與膽汁分泌的調(diào)節(jié)飽和能力有關(guān)。本研究中3例患兒均出現(xiàn)了SLCO1B1基因的c.1738C>T突變，文獻報道的此處突變可以造成蛋白功能缺失[7]。SLCO1B3基因中發(fā)生的大片段插入突變雖暫未有文獻收錄或報道，但其大片段的插入突變?nèi)菀滓鹨拼a突變而造成編碼蛋白功能喪失，結(jié)合本研究中3例患兒的臨床及血生化特征，排除溶血性及膽道梗阻性疾病后，診斷RS。

以往認為RS最初出現(xiàn)黃疸的年齡多為11～19歲[8]，但本研究中3例患兒起病年齡早，尤其是例2、例3患兒出生后不久即開始出現(xiàn)反復黃疸，從發(fā)現(xiàn)癥狀至確診的時間平均15.67個月，最短為4個月，最長為38個月。除黃疸外，查體無特異性發(fā)現(xiàn)，3例患兒生長發(fā)育正常，無明確家族史。血清膽紅素升高，以結(jié)合膽紅素增高為主，轉(zhuǎn)氨酶正常。新生兒SLCO1B1/OATP1B1和SLCO1B3/OATP1B3 mRNA的表達比成人低約500倍，12個月以下嬰兒比成人低100倍，因此，新生兒和嬰兒結(jié)合膽紅素的攝取、結(jié)合和排泄相關(guān)的轉(zhuǎn)運蛋白和酶的表達和活性均顯著降低[9]，發(fā)病年齡也可在新生兒期和嬰幼兒期。大多數(shù)的研究表明，OATPs是結(jié)合膽紅素的主要轉(zhuǎn)運蛋白[5]。但是，全基因組關(guān)聯(lián)分析表明，SLCO1B1/OATP1B1或SLCO1B3/OATP1B3活性降低的多態(tài)性與血清結(jié)合和非結(jié)合膽紅素的升高均有一定的相關(guān)性[4]，也就是說OATPs在肝細胞內(nèi)對未結(jié)合膽紅素的初始攝取中也發(fā)揮了作用。因此，部分患者可表現(xiàn)為結(jié)合和非結(jié)合膽紅素均有升高。本研究中例2患兒就有結(jié)合膽紅素和非結(jié)合膽紅素均升高的情況發(fā)生。

肝組織無明顯的結(jié)構(gòu)或細胞形態(tài)學異常，也無色素沉著，因此以往RS主要通過肝臟病理學檢查與Dubin Johnson綜合征相鑒別。通過基因檢測技術(shù)，本研究中3例患兒避免了創(chuàng)傷性肝臟病理學檢查并提高了幼齡兒童的早期診斷率。RS的膽紅素代謝障礙是從血漿到肝臟轉(zhuǎn)運水平的異常，而不是像Dubin-Johnson綜合征是肝細胞分泌膽紅素至膽小管途徑的紊亂[1-2]。

RS是良性的，不需要任何治療。但應(yīng)注意OATP1B蛋白還負責一些內(nèi)源性或外源性化合物及藥物的清除[1]，作為一種藥物轉(zhuǎn)運蛋白對藥物代謝動力學也具有影響，尤其是常用藥物如青霉素類，還有其他如他汀類藥物、利福平、甲氨蝶呤等藥物。SLCO1B基因的任一有害突變,即使沒有RS的臨床表現(xiàn),也可能會出現(xiàn)藥物使用毒性風險增加。本研究中例2患兒在應(yīng)用感冒藥物后出現(xiàn)黃疸加重是否與OATP1B蛋白對藥物代謝的影響有關(guān)，目前尚不清楚。

因此，臨床上對于兒童出現(xiàn)反復或持續(xù)的原因不明的高結(jié)合膽紅素血癥，又無明顯肝細胞損害的情況時，應(yīng)考慮到此病的可能。結(jié)合患兒臨床特征，選擇合適的檢查手段，及早行基因檢測，以明確病因，從而減少誤診的發(fā)生，避免過度治療。