參芪扶正注射液對支氣管擴(kuò)張癥伴銅綠假單胞菌感染患者Th17/Treg免疫失衡的影響

楊麗莉 ，王兆邦 ，陳芳 ，王婉華，廖雪

（東莞市濱海灣中心醫(yī)院1.健康管理科；2.呼吸內(nèi)科，廣東東莞 523900；3.暨南大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510630）

支氣管擴(kuò)張癥作為一種氣道慢性化膿性炎癥引起的支氣管樹病理性、永久性擴(kuò)張的肺疾病，頻繁反復(fù)發(fā)作不僅會(huì)引起肺功能惡化，還可能出現(xiàn)慢性肺源性心臟病甚至呼吸衰竭，加重患者病情[1]。病原體、宿主微生物群和宿主炎癥、免疫調(diào)節(jié)之間相互作用被證實(shí)為支氣管擴(kuò)張發(fā)生進(jìn)展的重要病理基礎(chǔ)[2]，而革蘭陰性菌作為支氣管痰檢陽性的主要致病菌，又以銅綠假單胞菌檢出率最高[3]。中醫(yī)認(rèn)為治療支氣管擴(kuò)張癥應(yīng)扶正驅(qū)邪、標(biāo)本兼治[4]，參芪扶正注射液作為臨床上輔助調(diào)節(jié)癌癥、肺炎、哮喘、慢性阻塞性肺病等調(diào)節(jié)免疫功能的藥物[5-6]，具有較好的應(yīng)用前景。相關(guān)研究結(jié)果表明，中性粒細(xì)胞作為支氣管擴(kuò)張癥最重要的炎癥細(xì)胞，當(dāng)患者處于急性加重或者細(xì)菌感染時(shí)水平顯著升高[7]，而輔助性T 細(xì)胞17（T helper cell 17,Th17）/調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（T rgulatory cells,Treg）作為機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，可通過影響中性粒細(xì)胞進(jìn)而調(diào)控細(xì)菌侵襲引起的炎癥反應(yīng)[8]。高遷移率族蛋白B1（high-mobilitygroup box1,HMGB1）作為關(guān)鍵的啟動(dòng)和維持炎癥瀑布式反應(yīng)的炎癥分子，影響多種炎癥疾病的進(jìn)展[9]；晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（receptor for advanced glycation end products,RAGE）作為免疫球蛋白超家族中第一個(gè)被鑒定出來HMGB1 受體，結(jié)合后可直接或間接的對Treg/Th17細(xì)胞產(chǎn)生影響[10]，但在支氣管擴(kuò)張癥疾病中的有關(guān)研究鮮少報(bào)道。本研究旨在探究參芪扶正注射液對銅綠假單胞菌感染支氣管擴(kuò)張癥患者體內(nèi)HMGB1/RAGE 通路表達(dá)及Th17/Treg免疫失衡的影響?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取東莞市濱海灣中心醫(yī)院2018年5月7日－2021年5月8日期間收治的58例支氣管擴(kuò)張合并銅綠假單胞菌感染患者為研究組。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合《成人支氣管擴(kuò)張癥診治專家共識(shí)》[11]中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）連續(xù)2次痰培養(yǎng)銅綠假單胞菌陽性；（3）年齡20～80歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）臨床資料不完整；（2）合并其他肺部疾病無法進(jìn)行肺泡灌洗術(shù)或?qū)ο嚓P(guān)用藥不耐受者；（3）痰培養(yǎng)合并其他病原菌；（4）合并嚴(yán)重心、肝、腎功能不全者；（5）入院前1個(gè)月內(nèi)接受過抗菌藥或免疫抑制藥物治療；（6）合并自身免疫缺陷病或血液系統(tǒng)疾病；（7）合并惡性腫瘤。另按1∶1配對納入58例體檢科正常人為健康對照組，入選標(biāo)準(zhǔn)：每年體檢，無腫瘤、糖尿病、冠心病、高血壓病、心力衰竭、慢性腎功能不全、周圍血管病、腦卒中等疾病。所有研究對象均對研究知情且自愿簽署同意書，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

研究組隨機(jī)數(shù)字表法分為A 組和B 組各29 例。A 組中男性10 例，女性19 例，年齡21～71 歲，平均（45.41±8.39）歲，體重指數(shù)平均（20.82±2.37）kg/m2；病程平均（7.32±3.19）年；FEV1占預(yù)計(jì)值（63.49±13.94）%，F(xiàn)VC占預(yù)計(jì)值（73.83±13.73）%；過去1年急性加重次數(shù)1次11例，2次及以上18例。B組中男性12例，女性17例，年齡20～74歲，平均（44.37±7.61）歲，體重指數(shù)平均（20.98±2.64）kg/m2；病程平均（7.83±3.52）年；FEV1占預(yù)計(jì)值（64.04±13.94）%，F(xiàn)VC 占預(yù)計(jì)值（73.57±12.98）%；過去1年急性加重次數(shù)1次12例，2次及以上17例。健康對照組中男性24例，女性34例，年齡20～73 歲，平均（45.04±8.39）歲，體重指數(shù)平均（20.33±2.45）kg/m2；FEV1 占預(yù)計(jì)值（83.49±8.94）%，F(xiàn)VC 占預(yù)計(jì)值（83.16±8.34）%。各組的性別、年齡、體重指數(shù)等比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 治療方法 A 組與B 組患者均給予霧化吸入、普通吸痰管吸痰、經(jīng)驗(yàn)性抗菌藥物、水電解質(zhì)平衡、營養(yǎng)支持及對癥治療等常規(guī)治療方式。A 組患者在此基礎(chǔ)上采取纖維支氣管鏡與肺泡灌洗術(shù)，術(shù)前4～6 h 禁食飲水，咽喉部局部麻醉后常規(guī)檢測心電、呼吸、血氧飽和度檢測，經(jīng)鼻插入纖維支氣管鏡，吸除氣道內(nèi)分泌物，將預(yù)先加熱至37 ℃的無菌生理鹽水（20 mL）以一次性注射器由吸引孔緩慢推入至支氣管內(nèi)，操作中注意觀察患者，避免嗆咳情況，負(fù)壓回收灌洗液，反復(fù)多次沖洗，直至液體清亮，收集灌洗液30～50 mL，將收回的液體經(jīng)無菌紗布去除黏液，放至無菌容器中，用于Th17/Treg 細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)檢測的樣本于24 h 內(nèi)檢測，炎性因子檢測的樣本于-70 ℃保存。B組患者在A組基礎(chǔ)上給予參芪扶正注射液（麗珠集團(tuán)利民制藥廠，國藥準(zhǔn)字Z19990065，規(guī)格：250 mL/瓶）輔助治療（取250 mL參芪扶正注射液行靜脈滴注，1 次/d）。灌洗術(shù)每周灌洗3次，兩組共持續(xù)治療14 d。

1.2.2 外周血樣本采集及單個(gè)核細(xì)胞分離 取健康對照組及研究組患者治療前、后空腹靜脈血5 mL各2支，1支置于枸櫞酸鈉抗凝劑的無菌試管中；1支置于的普通無菌干燥試管中，離心，提取上清液，然后置于-80 ℃冰箱備用。采用Ficoll 密度梯度離心法[12]分離得到外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）。

1.2.3 Western blot檢測外周血及灌洗液中HMGB1、RAGE 蛋白表達(dá) 使用蛋白提取試劑盒（購自北京索萊寶科技有限公司）提取單個(gè)核細(xì)胞及肺泡灌洗液中的總蛋白，采用Bradford 法測定蛋白濃度并調(diào)整各組蛋白濃度一致，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳、電轉(zhuǎn)膜至甲醛預(yù)處理過的PVDF 膜，密封2 h，加入兔抗人HMGB1、RAGE、GAPDH 一抗（1∶500）（均購自Thermo Fisher Scientific）4 ℃孵育過夜，TBST 漂洗40 min，加入HRP標(biāo)記的二抗（1∶500）孵育1 h，TBST漂洗40 min，ECL試劑盒與DNR BioImaging System觀察膜上蛋白條帶，收集影像，采用凝膠圖像處理系統(tǒng)軟件分析各組條帶灰度值，依據(jù)相對灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血及肺泡灌洗液中Th17、Treg 細(xì)胞占比 采用美國BD 生物科技有限公司生產(chǎn)的試劑盒處理樣品，流式細(xì)胞術(shù)檢測Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞水平。具體步驟見試劑盒說明書。

1.2.5 ELISA 技術(shù)檢測肺泡灌洗液及外周血中炎癥細(xì)胞因子水平 根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附試劑盒相關(guān)說明，檢測Th17、Treg 細(xì)胞占比及標(biāo)志性促炎細(xì)胞因子[白細(xì)胞介素-17（IL-17）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）]，抗炎細(xì)胞因子[轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）]水平。

1.3 觀察指標(biāo)

（1）健康對照組受試者及研究組患者單個(gè)核細(xì)胞及灌洗液中HMGB1、RAGE 蛋白表達(dá)水平；（2）健康對照組受試者及研究組患者單個(gè)核細(xì)胞及灌洗液中Th17、Treg 細(xì)胞占比及標(biāo)志性炎性細(xì)胞因子[白細(xì)胞介素-17（Interleukin 17，IL-17）、IL-6、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β，TGF-β1）、IL-10]水平；（3）A組和B組患者治療前后單個(gè)核細(xì)胞及灌洗液中HMGB1、RAGE 蛋白表達(dá)水平；（4）A 組和B 組患者治療前后單個(gè)核細(xì)胞及灌洗液中Th17、Treg細(xì)胞占比及IL-17、IL-6、TGF-β1、IL-10水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料符合正態(tài)分布采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究組與健康對照組結(jié)果比較

2.1.1 外周血中HMGB1、RAGE 蛋白表達(dá)及Th17、Treg細(xì)胞占比比較 研究組患者外周血中HMGB1、RAGE 蛋白表達(dá)水平均高于健康對照組（P＜0.01）；Th17 細(xì)胞占比高于健康對照組（P＜0.01），Treg 細(xì)胞占比低于健康對照組（P＜0.01）。見表1。

表1 兩組受試者單個(gè)核細(xì)胞中HMGB1、RAGE蛋白表達(dá)及外周血中Th17、Treg細(xì)胞占比比較Table 1 Comparison of HMGB1 and RAGE protein expression in mononuclear cells and Th17 and Treg cell levels in peripheral blood of two groups(,n=58)

表1 兩組受試者單個(gè)核細(xì)胞中HMGB1、RAGE蛋白表達(dá)及外周血中Th17、Treg細(xì)胞占比比較Table 1 Comparison of HMGB1 and RAGE protein expression in mononuclear cells and Th17 and Treg cell levels in peripheral blood of two groups(,n=58)

與健康對照組比較：**P＜0.01。

2.1.2 外周血炎性細(xì)胞因子水平比較 研究組患者外周血中IL-17、IL-6、TGF-β1、IL-10 水平高于健康對照組（P＜0.01）。見表2。

表2 兩組受試者外周血IL-17、IL-6、TGF-β1、IL-10水平比較Table 2 Comparison of peripheral blood IL-17,IL-6,TGF-β1 and IL-10 levels between the two groups(,n=58) ρ/(pg·mL-1)

表2 兩組受試者外周血IL-17、IL-6、TGF-β1、IL-10水平比較Table 2 Comparison of peripheral blood IL-17,IL-6,TGF-β1 and IL-10 levels between the two groups(,n=58) ρ/(pg·mL-1)

與健康對照組比較：**P＜0.01。

2.2 研究組A組和B組患者結(jié)果比較

2.2.1 外周血及肺泡灌洗液中HMGB1、RAGE 蛋白表達(dá)比較 與治療前比較，兩組患者治療后外周血及肺泡灌洗液中HMGB1、RAGE 蛋白均降低（P＜0.05），且B 組患者HMGB1、RAGE蛋白降低更顯著（P＜0.05）。見表3。

表3 研究組患者治療前后外周血及肺泡灌洗液中HMGB1、RAGE蛋白表達(dá)比較Table 3 Comparison of HMGB1 and RAGE expression in peripheral blood and alveolar lavage fluid between the two groupsbefore and after treatment(,n=29)

表3 研究組患者治療前后外周血及肺泡灌洗液中HMGB1、RAGE蛋白表達(dá)比較Table 3 Comparison of HMGB1 and RAGE expression in peripheral blood and alveolar lavage fluid between the two groupsbefore and after treatment(,n=29)

與同組治療前比較：*P＜0.05；與A組同時(shí)間點(diǎn)比較：#P＜0.05。

2.2.2 外周血及肺泡灌洗液中Th17、Treg細(xì)胞占比比較 與治療前比較，兩組患者治療后外周血及肺泡灌洗液中Th17 細(xì)胞占比降低，Treg 細(xì)胞水平升高（P＜0.05），且B 組患者Th17、Treg 細(xì)胞占比變化更顯著（P＜0.05）。見表4。

表4 研究組患者治療前后外周血及肺泡灌洗液中Th17、Treg細(xì)胞占比比較Table 4 Comparison of Th17 and Treg cell levels in peripheral blood and alveolar lavage fluid between the two groups before and after treatment(,n=29)%

表4 研究組患者治療前后外周血及肺泡灌洗液中Th17、Treg細(xì)胞占比比較Table 4 Comparison of Th17 and Treg cell levels in peripheral blood and alveolar lavage fluid between the two groups before and after treatment(,n=29)%

與同組治療前比較：*P＜0.05；與A組同時(shí)間點(diǎn)比較：#P＜0.05。

2.2.3 外周血及肺泡灌洗液中炎性細(xì)胞因子水平比較 與治療前比較，兩組患者治療后外周血及肺泡灌洗液中IL-17、IL-6 細(xì)胞水皮降低，TGF-β1、IL-10細(xì)胞水平升高（P＜0.05），且B 組患者上述炎癥細(xì)胞因子變化更顯著（P＜0.05）。見表5～表6。

表5 研究組患者治療前后外周血中IL-17、IL-6、TGF-β1、IL-10水平比較Table 5 Comparison of peripheral blood IL-17，IL-6，TGF-β1 and IL-10 levels between the two groups before and after treatment(,n=29) ρ/（pg·mL-1）

表5 研究組患者治療前后外周血中IL-17、IL-6、TGF-β1、IL-10水平比較Table 5 Comparison of peripheral blood IL-17，IL-6，TGF-β1 and IL-10 levels between the two groups before and after treatment(,n=29) ρ/（pg·mL-1）

與同組治療前比較：*P＜0.05；與A組同時(shí)間點(diǎn)比較：#P＜0.05。

表6 研究組患者治療前后肺泡灌洗液中IL-17、IL-6、TGF-β1、IL-10水平比較Table 6 Comparison of IL-17，IL-6，TGF-β1 and IL-10 levels in alveolar lavage fluid between the two groups before and after treatment(,n=29) ρ/(pg·mL-1)

表6 研究組患者治療前后肺泡灌洗液中IL-17、IL-6、TGF-β1、IL-10水平比較Table 6 Comparison of IL-17，IL-6，TGF-β1 and IL-10 levels in alveolar lavage fluid between the two groups before and after treatment(,n=29) ρ/(pg·mL-1)

與同組治療前比較：*P＜0.05；與A組同時(shí)間點(diǎn)比較：#P＜0.05。

3 討論

近側(cè)支氣管、管壁肌肉及彈性組織結(jié)構(gòu)的完整性破損是支氣管異常擴(kuò)張的病理表現(xiàn)，而在感染及其他外在因素多次反復(fù)作用下，上述支氣管結(jié)構(gòu)的損傷逐漸加重，會(huì)進(jìn)一步影響纖毛功能，氣道內(nèi)分泌物堵塞管腔，引流不暢又會(huì)加重感染[13-14]。一項(xiàng)Meta 觀察性隊(duì)列研究結(jié)果顯示，合并銅綠假單胞菌感染的支氣擴(kuò)張患者，其病情嚴(yán)重度指標(biāo)及生活質(zhì)量均差于未合并感染者[15]，這可能與銅綠假單胞菌感染導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，支氣管擴(kuò)張患者合并銅綠假單胞菌感染患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中HMGB1、RAGE蛋白水平高于健康對照組，提示HMGB1、RAGE 參與了炎癥反應(yīng)。據(jù)分析，銅綠假單胞菌持續(xù)定植引起支氣管內(nèi)皮細(xì)胞壞死，可能導(dǎo)致HMGB1活化，而RAGE 作為其受體，可以通過作用多種炎性細(xì)胞上核因子κB核轉(zhuǎn)位，進(jìn)一步促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的釋放引起炎性器官損傷[16]。

支氣管肺泡灌洗在對呼吸道分泌物清理以提高通暢程度的同時(shí)誘發(fā)咳嗽，促進(jìn)痰液及炎性物質(zhì)的吸收，有利于病灶的吸收[17-18]。本研究結(jié)果顯示，研究組（A組和B組）患者經(jīng)過灌洗治療，患者的炎癥反應(yīng)得到改善，其外周血單個(gè)核細(xì)胞及肺泡灌洗液中HMGB1、RAGE 蛋白水平降低；外周血及肺泡灌洗液中Th17細(xì)胞占比降低，Treg細(xì)胞占比升高；外周血及肺泡灌洗液中IL-17、IL-6水平降低，TGF-β1、IL-10水平升高。B組患者在A組基礎(chǔ)上給予參芪扶正注射液輔助治療，其上述炎癥細(xì)胞因子變化更顯著。

上述結(jié)果表明，參芪扶正注射液可改善支氣管擴(kuò)張癥伴銅綠假單胞菌感染患者炎癥狀況，可能與其影響HMGB1 通路、Th17/Treg 免疫平衡有關(guān)。在肺泡灌洗術(shù)治療的基礎(chǔ)上聯(lián)合參芪扶正注射液治療支氣管擴(kuò)張癥伴銅綠假單胞菌感染，能取得更好效果，值得臨床進(jìn)一步探討。