聚丙烯酸樹脂蒙脫石鑲嵌鹽酸倍他洛爾納米粒滴眼液的眼表代謝及體外刺激性評價

許慧慧，韓鑫玥，劉朔，趙雅文，李華梅，劉晗雨，楊帆，陳燕忠，潘育方，侯冬枝

（廣東藥科大學藥學院/廣東省局部精準遞藥制劑工程技術(shù)研究中心/廣東省藥物新劑型重點實驗室，廣東廣州 510006）

《醫(yī)宗金鑒·眼科心法要訣》和《證治準繩·雜病·七竅門》中記載：青光眼屬“五風內(nèi)障”中的青風內(nèi)障，其癥狀為“痰濕所致，火郁、憂思、忿怒之過”[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學認為青光眼是一組涉及視神經(jīng)及其相關(guān)組織的疾病，其特征是視野逐漸喪失、視神經(jīng)頭典型改變[2-4]。眼壓是青光眼診斷的重要參數(shù)，也是表征青光眼病程發(fā)展的主要危險因素，降低眼壓是唯一被證實可有效減緩病程的重要手段。目前，市面上有大量的抗青光眼藥物，主要包括降眼壓藥物（前列腺素衍生物、碳酸酐酶抑制劑、受體拮抗劑、腎上腺素能激動劑、副交感神經(jīng)藥物和高滲劑）和視神經(jīng)保護藥物（鈣離子通道阻滯劑、中藥制劑、神經(jīng)干細胞及神經(jīng)營養(yǎng)因子等）[5-8]。

鹽酸倍他洛爾（BH）不僅有降壓作用，還具有視神經(jīng)保護功能。本課題組前期試驗研究表明，將藥物BH 與黏土礦物蒙脫石（Mt）通過酸化嵌合形成復合物，可以調(diào)控藥物的釋放速率[9]。聚丙烯酸樹脂RS（ED RS）和RL（ED RL）因季銨鹽基團含量不同導致其溶脹性和親水性發(fā)生改變，通?？稍谝后w的滲入作用下“濾出”親水孔道，從而減緩藥物釋放。本研究采用溶劑揮發(fā)法制備聚丙烯酸樹脂載藥蒙脫石納米粒（ED-Mt-BH NPs），并制備成滴眼液，進一步考察其制劑學性質(zhì)、釋藥性能，初步研究其生物相容性及刺激性，為治療青光眼納米遞藥系統(tǒng)提供新的研究思路和實驗基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器與試藥

BSA124S-CW 萬分之一電子天平（賽多利斯科學儀器（北京）有限公司）；9SK8200LHC 超聲波清洗器（上?？茖С晝x器有限公司）；RCT Basic 基礎(chǔ)型數(shù)顯磁力攪拌器（德國艾卡公司）；JY 92-II 超聲波細胞粉碎儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；THZ-82氣浴恒溫振蕩器（上海宵漢實業(yè)發(fā)展有限公司）；UV-1800PC 紫外可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）；OSMOMAT 3000 basic 冰點滲透壓儀（德國Gonotec GmbH 公司）；Delsa Nano C激光衍射粒度分析儀（美國貝克曼庫爾特科技儀器有限公司）；FEI Talos F200S 透射電子顯微鏡（賽默飛世爾科技公司）。

聚丙烯酸樹脂RS（ED RS）和聚丙烯酸樹脂（ED RL），純度≥97%，上海昌為醫(yī)藥輔料技術(shù)有限公司；鹽酸倍他洛爾（BH，純度99.5%，武漢遠成共創(chuàng)科技有限公司）；DMEM/F12 培養(yǎng)基（美國賽默飛世爾公司）；噻唑藍（MTT，美國Amresco公司）。

1.2 動物及細胞

普通級的新西蘭兔，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，雌雄不限。動物合格證號：SCⅩK（粵）2016-0041。HCE-T細胞由北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院商城分院提供（校內(nèi)贈送）。

2 方法與結(jié)果

2.1 ED-Mt-BH NPs混懸滴眼液的制備

采用改良O/W型乳化溶劑揮發(fā)法制備ED-Mt-BH NPs 滴眼液[10]：用泊洛沙姆188 的去離子水溶液20 mL 為外水相，將ED RL 425.6 mg、ED RS 22.4 mg、BH 56 mg 和Mt-BH 10 mg 于5 mL 無水乙醇中超聲溶解分散為油相；將油相快速液下注入外水相中，迅速置于冰水浴中超聲，隨后置于室溫中以800 r/min 繼續(xù)攪拌2～3 h，得到規(guī)格為2.8 mg/mL的ED-Mt-BH NPs 混懸滴眼液。將ED-Mt-BH NPs滴眼液（甘露醇為凍干保護劑，-60 ℃下恒壓預凍8 h，升華干燥）進行凍干后保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 ED-Mt-BH NPs混懸滴眼液的制劑學性質(zhì)考察

2.2.1 形態(tài)學 取適量稀釋適當倍數(shù)后的ED-Mt-BH NPs 混懸滴眼液，滴加到銅網(wǎng)上，自然晾干后，繼續(xù)滴加質(zhì)量分數(shù)2%的磷鎢酸溶液進行負染，自然晾干后采用透射電子顯微鏡（200 kV 加速電壓、低真空度）觀察ED-Mt-BH NPs的形態(tài)并攝影記錄，結(jié)果見圖1?？梢?，ED-Mt-BH NPs 混懸滴眼液呈淡藍色，經(jīng)激光光束垂直照射后出現(xiàn)膠粒分散系統(tǒng)的丁達爾現(xiàn)象（圖1C），TEM 鏡下的粒子大小較均勻（圖1A），形態(tài)圓整（圖1B）。

圖1 ED-Mt-BH NPs（A）、單個ED-Mt-BH NPs（B）的TEM形貌圖與ED-Mt-BH NPs混懸液（C）外觀圖Figure 1 TEM images of ED-Mt-BH NPs（A）and single ED-Mt-BH NPs（B），diagram of ED-Mt-BH NPs suspension（C）

2.2.2 pH 值和滲透壓 沙氏磷酸緩沖液的配制：0.943 8%無水Na2HPO4（堿性溶液）和0.8%無水NaH2PO4（酸性溶液），不同比例混合后可得到pH 范圍為5.19～8.04 的溶液。取2 mL 沙氏磷酸緩沖液（按1∶1比例混合堿性溶液和酸性溶液）復溶納米粒凍干粉末，充分搖勻后備用。將ED-Mt-BH NPs混懸滴眼液用pH計測定pH值。另外取50 μL ED-Mt-BH NPs 滴眼液于滲透壓儀下測量滲透壓。重復試驗3次，結(jié)果見表1。

2.2.3 包封率和載藥量 精密移取0.5 mL ED-Mt-BH NPs 混懸滴眼液于10 mL 容量瓶中并用甲醇定容，渦旋4 min 后超聲2 h 破乳，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜濾過，紫外可見分光光度計273 nm 下測定吸光度值代入標準曲線（Y=4.141X-0.006，R2=0.998 6）中計算BH 的全藥量c0。精密移取4 mL ED-Mt-BH NPs 混懸滴眼液于透析袋中，扎緊透析袋兩端后放置于提前預熱的100 mL 人工淚液介質(zhì)中，空氣浴恒溫（34 ℃）振蕩（轉(zhuǎn)速為120 r/min）0.5 h 后取出，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，紫外可見分光光度計273 nm下測定吸光度值代入標準曲線（Y=3.876X+0.003，R2=0.999 8）中計算游離BH 的質(zhì)量濃度c。根據(jù)以下公式分別算出包封率和載藥量：

式中：c0為納米粒的全藥量（mg/mL），c為納米?；鞈乙褐杏坞x藥物質(zhì)量濃度（mg/mL），w1為加入藥物的質(zhì)量（mg），w2為納米粒中游離藥物質(zhì)量（mg）；w為納米?？傎|(zhì)量（mg）。結(jié)果見表1。

表1 ED-Mt-BH NPs的理化性質(zhì)Table 1 Physicochemical properties of ED-Mt-BH NPs(,n=3)

表1 ED-Mt-BH NPs的理化性質(zhì)Table 1 Physicochemical properties of ED-Mt-BH NPs(,n=3)

可見，ED-Mt-BH NPs混懸液的pH值、滲透壓均符合2020年版《中國藥典》眼用制劑通則的相關(guān)要求。所制納米粒滴眼液Zeta電位為（22.24±1.53）mV，這可能是由于含季銨鹽的聚丙烯酸樹脂聚合物載體和陽離子型藥物BH均提供了正電荷。

2.2.4 體外釋放試驗 采用動態(tài)透析法進行體外釋放度測試，按處方配制好人工淚液后，將透析袋（截留相對分子質(zhì)量：8 000～14 000）浸泡于人工淚液中放置過夜處理。分別精密量取BH 溶液、ED-Mt-BH NPs 混懸滴眼液液4 mL 于透析袋中并扎緊兩端避免漏液，浸泡于100 mL 人工淚液。整體置于34 ℃恒溫的空氣浴恒溫振蕩儀中，轉(zhuǎn)速設(shè)為120 r/min。于特定的時間間隔內(nèi)精密移取5 mL介質(zhì)，同時補給同樣體積新配制的介質(zhì)。經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜濾過，棄去初濾液，紫外可見分光光度法273 nm 下測定續(xù)濾液的吸光度值。按以下公式計算累積釋放率：

式中：W是累積釋放率；Cn為第n個取樣時間點介質(zhì)中藥物濃度；V是釋放介質(zhì)的總體積；Ci是第i個取樣時間點時介質(zhì)中藥物濃度；Vi是第i個取樣時間點的取樣體積，m為4 mL 納米粒中所含的總的藥量。結(jié)果見圖2。

圖2 ED-Mt-BH NPs混懸滴眼液和BH溶液的體外累積釋放曲線Fiugre 2 In vitro cumulative release curves of ED-Mt-BH NPs suspension and BH solution

可見，ED-Mt-BH NPs 混懸液前2 h 累積釋放率較快，達到65.2%，呈現(xiàn)出快速釋放現(xiàn)象；隨著時間的推移，釋放率逐漸變小，呈現(xiàn)緩慢釋放現(xiàn)象，10 h時累積釋放率達到87.7%。藥物從顆粒中釋放主要有3種途徑：（1）從顆粒表面釋放；（2）經(jīng)載體基體溶脹釋放；（3）由于聚合物被侵蝕釋放。本研究采用的載體材料聚丙烯酸樹脂在水中可溶脹形成孔道，藥物通過親水孔道擴散釋放，同時在本課題組前期研究中證明層狀結(jié)構(gòu)的載鹽酸倍他洛爾蒙脫石可與透析介質(zhì)中陽離子發(fā)生陽離子交換作用從而使藥物緩慢釋放，進而調(diào)節(jié)藥物的釋放速度[11-12]，推測聚丙烯酸樹脂和蒙脫石的聯(lián)合應(yīng)用可以雙重控制藥物釋放。將ED-Mt-BH NPs混懸液的累積釋放率（Q）對時間（t）分別進行零級方程、一級方程、Higuchi方程、Ritger-Pepppas方程和Weibull方程擬合，結(jié)果見表2?？梢?，ED-Mt-BH NPs 混懸滴眼液在人工淚液介質(zhì)中的釋放機制與Weibull釋藥模型較接近。

表2 ED-Mt-BH NPs混懸滴眼液體外釋放擬合結(jié)果Table 2 Fitting results of in vitro release of ED-Mt-BH NPs suspension eye drops

2.3 ED-Mt-BH NPs混懸滴眼液的眼表代謝動力學

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Inertsil ODS C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；檢測波長：273 nm；流動相：乙腈-0.2%三乙胺（體積比3∶7，pH=3）；流速：1.0mL/min；進樣量：20 μL。

2.3.2 樣品處理 將3 cm×8 cm的濾紙條置于1.5 mL離心管內(nèi)，取樣前精密稱其總質(zhì)量G0。取樣后立即稱定潤濕有淚液的濾紙條與離心管的總質(zhì)量G1。氮氣流下吹干含有淚液的濾紙條后加入10 μg/mL的內(nèi)標物尼泊金乙酯（Ethyl paraben，EP）70 μL，吹干后加入70 μL 甲醇復溶，渦旋5 min，超聲萃取處理20 min，15 000 r/min離心20 min，進樣20 μL。

2.3.3 線性關(guān)系 將系列濃度的BH 標準溶液20 μL加入到含空白淚液濾紙條的離心管中，吹干后加入20 μL EP（35 μg/mL），吹干后再加入70 μL 甲醇復溶，使得處理后樣品中的藥物終質(zhì)量濃度為1、10、40、120、300 μg/mL，渦旋5 min，超聲20 min，15 000 r/min低溫離心20 min，小心吸取上清液20 μL進樣。記錄待測藥物BH 的峰面積和內(nèi)標物EP 的峰面積。以質(zhì)量濃度為橫坐標、峰面積比為縱坐標得線性方程：Y=0.006 87X+0.006 8，R2=0.999 0。

2.3.4 淚液消除試驗 選取健康無眼疾的新西蘭兔，左眼給生理鹽水做空白對照，右眼給各受試制劑。左右眼各給藥50 μL。在特定時間點，拉開兔眼上眼瞼，輕輕放入濾紙條并輕壓鼻淚管處，1 min 后取出立即精密稱量，通過增重量確定取樣量的多少。所有樣品于-20 ℃下保存?zhèn)溆?，按?.3.2”項方法處理，按“2.3.1”項測定。結(jié)果見圖3。

圖3 BH 溶液和ED-Mt-BH NPs 混懸滴眼液兔眼局部給藥50 μL后兔淚液中的藥-時曲線Figure 3 The concentration-time curves of the drug in tears after topical administration of 50 μL of BH solution and ED-Mt-BH NPs suspension to the rabbit eyes（n=3）

表3列出了由DAS 3.1.1（北京邦茨公司）的非房室分析得出的平均藥動學參數(shù)?？梢?，ED-Mt-BH NPs混懸滴眼液的相對生物利用度和平均滯留時間分別是BH 溶液的1.88倍和1.54倍，表明ED-Mt-BH NPs滴眼液可明顯延長藥物在眼表的滯留。

表3 BH溶液和ED-Mt-BH NPs滴眼液的主要藥動學參數(shù)Table 3 The pharmacokinetic parameters of BH solution and ED-Mt-BH NPs suspension(,n=3)

表3 BH溶液和ED-Mt-BH NPs滴眼液的主要藥動學參數(shù)Table 3 The pharmacokinetic parameters of BH solution and ED-Mt-BH NPs suspension(,n=3)

2.4 ED-Mt-BH NPs混懸滴眼液的刺激性試驗

2.4.1 溶血試驗 取健康家兔耳緣靜脈血液樣品2 mL，輕輕攪拌取出纖維蛋白，加入PBS溶液2 mL后離心5 min，棄去上清液，繼續(xù)加入PBS 溶液10 mL 離心5 min，棄去上清液并重復上述操作4～5 次直至上清液基本無明顯紅色。將所得的紅細胞用PBS 溶液稀釋成體積分數(shù)為2%的紅細胞混懸液備用。

分別向0.2 mL 紅細胞溶液加入PBS 溶液（陰性對照組）、去離子水（陽性對照組）、ED-Mt-BH NPs（待測樣品組），于37 ℃下孵育4 h 后離心5 min，觀察上清液顏色。分別取各組的上清液100 μL 于96孔板中，利用酶標儀（λ=570 nm）測定其吸光度并計算溶血率，結(jié)果顯示ED-Mt-BH NPs∶PBS 稀釋比為1∶7、4∶4、8∶0 時，溶血率分別為1.47%、2.35%和3.82%。溶血率與藥物濃度存在一定的線性關(guān)系，溶血率小于5%，表明所制備的ED-Mt-BH NPs 對兔紅細胞幾乎無溶血作用。

過敏性、溶血性是指藥物制劑經(jīng)皮膚、黏膜、血管等非口服途徑給藥，對用藥局部產(chǎn)生的毒性或?qū)θ懋a(chǎn)生的毒性，是臨床前安全性評價的重要組成部分[13]。如圖4 所示：陰性對照組紅細胞下沉且上清液無色透明，未發(fā)生溶血現(xiàn)象；陽性對照組呈現(xiàn)出紅色澄明狀，管底僅有少量紅細胞殘留，明顯發(fā)生溶血；ED-Mt-BH NPs 樣品組各管均紅細胞下沉，上清液無色透明，未出現(xiàn)溶血或凝聚現(xiàn)象。

圖4 各受試組溶血情況Figure 4 The hemolysis of each test group

2.4.2 細胞毒性試驗[14-15]將生長良好的HCE-T 細胞以1×104/孔接種于含有DMEM/F12 培養(yǎng)基96 孔板，將96孔板放在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，更換培養(yǎng)基。加入不同梯度濃度的BH溶液、ED-Mt-BH NPs 滴眼液和Blank-NPs 滴眼液，同時用相同體積的培養(yǎng)基做陰性對照。在原培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)0.5 h 和2 h 后每孔加入100 μL MTT（5 mg/mL）孵育4 h，最后向每個孔滴加100 μL 二甲基亞砜，置于恒溫振蕩儀往復振蕩直至所有藍紫色晶體甲瓚溶解。用酶標儀（λ=570 nm）檢測樣本孔的吸光度值（A）并計算生長抑制率（%），結(jié)果見圖5。可見，暴露時間為0.5 h和2 h時，各制劑的細胞毒性均隨著給藥劑量的增加而增大；但Blank-NPs溶液的細胞毒性始終低于BH 溶液和包裹藥物后的ED-Mt-BH NPs，且差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表明ED-Mt-BH NPs滴眼液可減輕BH 藥物固有的細胞毒性，側(cè)面說明納米?？蓪⑺幬顱H有效包裹于顆粒中。

圖5 BH溶液、Blank-NPs溶液和ED-Mt-BH NPs滴眼液分別暴露0.5 h（A）和2 h（B）時的細胞毒性Figure 5 Cytotoxicity of BH solution,Blank-NPs solution and ED-Mt-BH NPs suspension exposed to 0.5 h(A)and 2 h(B)

3 討論

基于青光眼是世界上第二大致盲性眼部疾病與傳統(tǒng)眼用制劑普遍具有較低生物利用度的現(xiàn)狀，一種新興眼部給藥系統(tǒng)即眼部納米粒制劑被設(shè)計開發(fā)，該系統(tǒng)具有改善顆粒與黏液相互作用，增加藥物滲透角膜能力，增加藥物在眼內(nèi)組織聚集，延長藥物滯留時間并減少臨床用藥頻率，提高患者依從性等優(yōu)勢。

本研究制備了聚丙烯酸樹脂載藥蒙脫石納米粒（ED-Mt-BH NPs），并對其理化性質(zhì)、載藥量和包封率、釋藥能力進行了研究，結(jié)果表明ED-Mt-BH NPs 的理化性質(zhì)符合眼用制劑的要求標準，可用于眼部治療，且具有較高的包封率和載藥量。通過體外釋放試驗結(jié)果可知，將BH 制備成ED-Mt-BH NPs 可降低藥物釋放速率，延長藥物釋放時間。

目前，國內(nèi)外常用的體外眼部刺激性試驗分別有牛眼角膜滲透性試驗和雞胚尿囊膜試驗[16]。由于每個方法均有局限性和優(yōu)勢，因此本研究采用組合策略，可較全面評價眼用輔料的安全性。紅細胞溶血試驗已經(jīng)被納入歐洲委員會英國內(nèi)務(wù)府開展的替代家兔眼刺激性試驗之一[17]。本研究通過紅細胞溶血試驗考察ED-Mt-BH NPs 的毒性，結(jié)果表明相比于去離子水，ED-Mt-BH NPs 幾乎無溶血作用，且隨著ED-Mt-BH NPs 與PBS 的稀釋比增加，溶血率增加，這可能是由于納米粒中游離藥物分子引起的刺激性；不同稀釋比的ED-Mt-BH NPs-PBS稀釋液的溶血度均小于去離子水的溶血度，表明ED-Mt-BH NPs 具有較小的毒性。對于青光眼這一類慢性疾病，眼用制劑應(yīng)長期給藥，有研究表明納米制劑因呈正電性、比表面積大和表面反應(yīng)活性強等特點可能存在潛在毒性[18]，但是對局部眼用制劑存在復雜性，如納米粒與眼組織的相互作用、藥物在眼部分布情況及其代謝等相關(guān)機制研究仍不完善，后續(xù)將進一步考察ED-Mt-BH NPs的長期安全性。

通過試驗手段誘導動物高眼壓是研究青光眼藥理藥效的重要手段，目前研究中的動物造模使用最多的是兔子和大鼠[19]。根據(jù)青光眼發(fā)病機制，造模方法常分為3 大類：破壞小梁結(jié)構(gòu)（如高滲鹽水法[20]、透明質(zhì)酸法[21]、激光誘導法[22]）、增加上鞏膜靜脈竇壓力（如燒灼上鞏膜靜脈法）和阻塞房角流出通道（如α-糜蛋白酶法、甲基纖維素法、皮質(zhì)類固醇法、復方卡波姆法和血細胞法）。后續(xù)本課題組將繼續(xù)研究構(gòu)建合適的青光眼動物模型以觀察ED-Mt-BH NPs 的降眼壓療效。