小兒咳喘靈顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升

劉薇，肖文濤，楊群，鄧維

1.九江市食品藥品檢驗(yàn)所，江西 九江 332000；2.江西省藥品檢驗(yàn)檢測研究院，國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330029

小兒咳喘靈顆粒是由麻黃、金銀花、板藍(lán)根、苦杏仁、甘草、石膏和瓜蔞七味藥組成的成方制劑，收錄于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑》第四冊（WS3-B-0688-91），具有宣肺、清熱，止咳、祛痰、平喘功效［1］。臨床常用于上呼吸道感染，氣管炎，肺炎，咳嗽等［2］?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下僅有兩項(xiàng)化學(xué)鑒別，未涉及薄層色譜鑒別及含量測定指標(biāo)和方法,無法對處方中的有效成分進(jìn)行質(zhì)量控制。本研究擬用薄層色譜法對制劑中的苦杏仁中的苦杏仁苷進(jìn)行定性鑒別，對處方中5 種成分鹽酸麻黃堿、（R，S）-告依春、綠原酸、木犀草苷、甘草苷的含量用同一液相色譜系統(tǒng)同時(shí)測定，為進(jìn)一步提高小兒咳喘靈顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695-2695 高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；YIY-UL300W-C 型超聲波清洗器（上海藝源超聲設(shè)備有限公司）；BSA124S 型電子天平（德國sartorius 公司）；BP211D 型電子天平（德國sartorius 公司）；硅膠G 薄層板（10 cm×20 cm，德國默克公司）。

1.2 材料

鹽酸麻黃堿（批號為171241-201007，含量以99.7%計(jì)）；（R，S）-告依春（批號為111753-201106，含量以100% 計(jì)）；綠原酸（批號為110753-201716，含量以98.0%計(jì)）；木犀草苷（批號為111720-200504，含量以100%計(jì)）；甘草苷（批號為111610-201005，含量以94.9%計(jì)）；苦杏仁苷（批號為110820-201808，含量以88.2%計(jì)）對照品購自中國食品藥品檢定研究院。甲醇和磷酸為色譜純；水為超純水；其余試劑均為分析純。3 批小兒咳喘靈顆粒樣品（批號：190405、190512、191203，規(guī)格為每袋2 g）均購自四川恩威制藥有限公司，依次編號為A1～A3。

2 方法與結(jié)果

2.1 苦杏仁苷TLC 鑒別

供試品溶液：取小兒咳喘靈顆粒6 g，加乙醚低溫超聲30 min，棄去乙醚液，藥渣揮干；加甲醇30 mL 超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀? mL 使溶解，通過D101 型大孔吸附樹脂柱（內(nèi)徑1.5 cm，長8 cm，加水20 mL 預(yù)洗一次），棄去水液，用氨試液30 mL 洗脫，棄去氨液，再用水10 mL洗脫，棄去水液，用20%乙醇溶液30 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL 使溶解，即得［3］。對照品溶液：取苦杏仁苷對照品，加甲醇制成每1 mL 含2 mg 的溶液。按處方比例和制法制備缺苦杏仁的陰性對照品溶液。照薄層色譜法（《中國藥典》2015 年版四部通則0502）試驗(yàn)，吸取供試品溶液3 μL，對照品溶液與陰性對照品溶液各3 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15∶40∶22∶10）5～10 ℃放置12 h 的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以磷鉬酸硫酸溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)且陰性對照無干擾。結(jié)果見圖1（日光）。

圖1 薄層色譜圖

2.2 5 種成分的含量測定［4-15］

2.2.1 色譜條件 采用Venusil MP C18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸；梯度洗脫；流速：1.0 mL/min；檢測波長：0～15 min，207 nm；15～25 min，327 nm；25～35 min，237 nm；35～40 min，350 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序表

2.2.2 對照品溶液的配制 精密稱取鹽酸麻黃堿對照品15.79 mg，置25 mL 容量瓶中，加甲醇適量，超聲處理15 min，取出，放冷加適量甲醇定容，制成629.70 μg/mL 的對照品儲備液。精密稱取綠原酸對照品9.32 mg，置25 mL 容量瓶中，超聲處理15 min，加適量甲醇定容，制成365.30 μg/mL 的對照品儲備液。精密稱取告依春對照品9.66 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇適量，超聲處理15 min，放冷，甲醇定容，制成386.40 μg/mL 的對照品儲備液。精密稱取甘草苷對照品8.01 mg，置25 mL 容量瓶中，超聲處理15 min，加適量甲醇定容，制成304.00 μg/mL 的對照品儲備液。精密稱取木樨草苷對照品9.17 mg，置25 mL 容量瓶中，超聲處理15 min，加適量甲醇定容，制成366.80 μg/mL 的對照品儲備液。

2.2.3 樣品溶液的制備 取樣品，研細(xì)，從中稱取約2 g，精密稱定，加入甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理（功率300 W，頻率25 kHz）20 min，放冷后，再次稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得樣品溶液。

2.2.4 專屬性實(shí)驗(yàn) 分別吸取供試品溶液、對照品溶液以及陰性對照溶液各10 μL，注入液相色譜儀測定，比較供試品溶液、對照品溶液及陰性對照溶液色譜圖。結(jié)果表明供試品中五種色譜峰與雜質(zhì)峰有較好的色譜分離，陰性對照無干擾。見圖2。

圖2 高效液相色譜圖：A.對照品溶液；B.小兒咳喘靈顆粒樣品溶液；C.陰性對照溶液

2.2.5 線性關(guān)系的考察 取綠原酸對照品儲備液，分別加適量甲醇制成1 mL 中含3.65、7.31、14.61、21.92、29.22、36.50 μg 綠原酸的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，使用高效液相色譜儀進(jìn)行測定，以其質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=21 084.595 2X+28.329 1，r=0.999，綠原酸在3.65～36.50 μg/ mL 之間呈良好的線性。

取鹽酸麻黃堿對照品儲備液，分別加適量甲醇制成1 mL 中含6.29、12.59、25.18、37.78、50.37、62.97 μg 鹽酸麻黃堿的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，使用高效液相色譜儀進(jìn)行測定，以其質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=25 351.509X-5 999.754 3，r=0.999，鹽酸麻黃堿在6.29～62.97 μg/ mL 之間呈良好的線性。

取告依春對照品儲備液，分別加適量甲醇制成1 mL 中含3.86、7.72、15.45、23.18、30.91、38.64 μg告依春的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，使用高效液相色譜儀進(jìn)行測定，以其質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=180 916.440 2X-10 717.480 5，r=0.999,告依春在3.86～38.64 μg/mL之間呈良好的線性。

取木樨草苷對照品儲備液，分別加適量甲醇制成1 mL 中含3.67、7.34、14.67、22.01、29.34、36.68 μg木樨草苷的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，使用高效液相色譜儀進(jìn)行測定，以其質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=41 563.933 2X-3 956.141 3，r=0.999，木犀草苷在3.67～36.68 μg/mL 之間呈良好的線性。

取甘草苷對照品儲備液，分別加適量甲醇制成1 mL 中含3.04、6.08、12.16、18.24、24.32、30.40 μg 甘草苷的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，使用高效液相色譜儀進(jìn)行測定，以其質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=22 763.873 5X-391.572 6，r=0.999,甘草苷在3.04～30.40 μg/ mL 之間呈良好的線性。

2.2.6 精密度試驗(yàn) 取濃度為36.50 μg/mL 的綠原酸對照品溶液，按上述色譜條件連續(xù)測定6 次峰面積，RSD 值為0.40%。取濃度為62.97 μg/mL 的鹽酸麻黃堿對照品溶液，按上述色譜條件連續(xù)測定6次峰面積，RSD 值為0.33%。取濃度為38.64 μg/mL的告依春對照品溶液，按上述色譜條件連續(xù)測定6次峰面積，RSD 值為0.29%。取濃度為36.68 μg/mL的木樨草苷對照品溶液，按上述色譜條件連續(xù)測定6 次，RSD 值為0.33%。取濃度為30.40 μg/mL 的甘草苷對照品溶液，按上述色譜條件連續(xù)測定6 次峰面積，RSD 值為0.26%。證明精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取小兒咳喘靈顆粒2 g，按“2.2.3”的方法制備樣品溶液，精密吸取供試品溶液（批號：191203）10 μL，分別放置0、2、4、8、12、24 h后進(jìn)樣測定，結(jié)果表明樣品溶液中綠原酸、鹽酸麻黃堿、告依春、木樨草苷、甘草苷在24 h 內(nèi)峰面積無明顯變化，RSD 分別為1.2%、1.1%、1.6%、1.8%、1.3%。

2.2.8 回收率試驗(yàn) 精密稱取樣品1.0 g，共六份，置25 mL 量瓶中，分別加入+含鹽酸麻黃堿對照品（0.103 mg/mL）、綠原酸對照品（4.040 mg/mL）、告依春對照品（0.204 mg/mL）、甘草苷對照品（0.458 mg/mL）和木樨草苷對照品（0.101 mg/mL）各0.8、1.0、1.2 mL，加入甲醇15 mL，超聲處理（功率300 W，頻率25 kHz）20 min，定容，搖勻，濾過，按上述色譜條件測定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表2～6。

表2 鹽酸麻黃堿回收率

表3 綠原酸回收率

表4 告依春回收率

表5 甘草苷回收率

表6 木樨草苷回收率

2.2.9 樣品含量測定 精密稱取小兒咳喘靈顆粒樣品適量，按“2.2.3”的方法制備樣品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣測定2 次，計(jì)算樣品中5 種成分的含量，結(jié)果見表7。

表7 樣品中5種成分的含量測定結(jié)果（mg/袋）

3 討論

3.1 苦杏仁苷的薄層色譜鑒別

現(xiàn)行檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)未對處方中苦杏仁藥材進(jìn)行質(zhì)量控制，查閱相關(guān)文獻(xiàn)少見小兒咳喘靈顆粒研究方法中對苦杏仁的鑒別方法。在試驗(yàn)中參考苦杏仁藥材的薄層方法［16］，同時(shí)對比用索氏提取、二次回流、超聲提取等不同提取方法，結(jié)果分離效果不理想，苦杏仁陰性樣品斑點(diǎn)干擾成分較多?？紤]處方中藥材成分互相干擾，組方中有多數(shù)含糖成分，會造成不易分離且拖尾等，為了改善分離效果，故用大孔樹脂柱層析法，結(jié)果證明用大孔樹脂柱層析法能有效洗脫雜質(zhì)干擾成分，且分離效果較好，陰性對照無干擾。

3.2 含量提取方法優(yōu)化

對提取溶劑（甲醇、75%乙醇、50%甲醇、水），提取方法（超聲法、回流法、浸提法），提取時(shí)間（10、30、40、60 min）進(jìn)行了比較，最后確定用50%甲醇超聲處理30 min 為最佳。

3.3 流動相選擇

比較乙腈-0.1%磷酸、甲醇和水兩種系統(tǒng)，其中乙腈-0.1%磷酸峰形及分離度較好，保留時(shí)間也較為理想。也考察了磷酸的濃度0.1%、0.2%、0.3%。其中0.1%的磷酸濃度分離效果較好，故選擇表1中的梯度洗脫法。

3.4 檢測波長選擇

木犀草苷的最大波長是350 nm，而鹽酸麻黃堿、（R，S）-告依春、綠原酸、甘草苷分別為207、245、237 nm，不能以同一波長對這5 種成分進(jìn)行紫外檢測。經(jīng)實(shí)驗(yàn)用紫外檢測液相色譜法直接切換不同波長進(jìn)行含量測定方法較為方便，同時(shí)在同一個系統(tǒng)中測定5 個組分，故選用波長切換法進(jìn)行檢測。

本研究對小兒咳喘靈顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了相應(yīng)提升，建立的薄層鑒別和含量測定方法專屬性強(qiáng)，能有效對小兒咳喘靈顆粒的質(zhì)量進(jìn)行控制。