蛇床子素抑制NLRP3炎癥體及對血管性癡呆大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用研究

張 放 汪玲紅 王祥云 黃 櫻

（贛南醫(yī)學(xué)院第一臨床醫(yī)學(xué)院，江西 贛州 341000）

0 引言

血管性癡呆（Vascular Dementia，VD）是可導(dǎo)致認(rèn)知障礙的一類疾病，產(chǎn)生的機(jī)制主要有細(xì)胞焦亡（Pyroptosis）、中樞膽堿能系統(tǒng)的破壞、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激損傷等[1]。其中，細(xì)胞焦亡與VD發(fā)病的關(guān)系漸受關(guān)注。研究表明，細(xì)胞焦亡的發(fā)生發(fā)展始于Caspase-1的激活，而Caspase-1的激活受NOD樣受體（NLR）的調(diào)控。構(gòu)成NLRs的關(guān)鍵成員：NOD樣受體家族熱蛋白結(jié)構(gòu)域3（NLRP3），被認(rèn)為是將血管疾病與神經(jīng)炎癥和腦部疾病緊密聯(lián)系的樞紐，在其中發(fā)揮著重要作用[2]。

蛇床子素（Osthole）是一種呋喃香豆素，具有抑制抗氧自由基損傷、抗炎及改善記憶的作用[3，4]。既往發(fā)現(xiàn)，皮層組織中的NLRP3炎性體在慢性腦缺血的炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。本文從動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)著手，探討蛇床子素是否能通過抑制NLRP3炎性體激活而抵抗癡呆，進(jìn)而深入探討蛇床子素的機(jī)制作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

選用潔凈環(huán)境成長的雄性SD大鼠（重量150～180 g，n=30，贛南醫(yī)學(xué)院SPF動物房供給的健康大鼠）。

1.2 藥物、試劑和儀器

凝膠成像儀、電泳儀（Bio-Rad）；蛇床子素粉劑（成都埃法生物科技有限公司）；PCR儀（ABI）；NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18和β-actin（Abcam）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物造模、分組及給藥

用改良的兩側(cè)頸總動脈永久性結(jié)扎術(shù)制備VD動物模型。隨機(jī)將大鼠平均分為五組：假手術(shù)、VD模型、蛇床子素干預(yù)組（10，25，40 mg/kg）。鼠麻醉蘇醒后向其腹腔注射藥物，1天1次，共給藥12周。其余組生理鹽水同法等量給予。

1.4 Morris水迷宮測試

能夠成功找到水中臺子的規(guī)定時間是120 s。大鼠找到臺子實(shí)際所需的時間是逃避潛伏期（EL）。

1.5 熒光實(shí)時定量PCR

總RNA用Trizol加至組織樣本來提出，加逆轉(zhuǎn)錄試劑，反應(yīng)體系為20μL，置于儀器中反應(yīng)擴(kuò)增。引物設(shè)計及合成由公司完成（上海生工生物）。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）

加RIPA裂解大鼠海馬組織，四度離心機(jī)處理，上清用于后續(xù)操作；以BCA（bicinchoninic acid）方式定量蛋白。SDS-聚丙烯酰胺膠（10%～12%）分離，轉(zhuǎn)膜后蛋白封閉1 h，4度冰柜一抗過夜，于室溫孵二抗1 h，常規(guī)化學(xué)法顯影。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)統(tǒng)計用SPSS23.0，計量資料的結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差呈現(xiàn)。單因素方差分析統(tǒng)計各個組之間數(shù)據(jù)，P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蛇床子素對VD大鼠認(rèn)知功能的作用

定位航行結(jié)果顯示，VD組大鼠EL（46.6438.371s）較假手術(shù)組（23.0245.125s）時間延長（P<0.05）；蛇床子素治療各組大鼠的EL與VD組相比均縮短，但仍高于假手術(shù)組；治療組組間比較提示，中劑量組大鼠的EL（36.3302.534s）、高劑量組大鼠的EL（34.2254.326s）顯著低于低劑量組大鼠的EL（40.2892.112s），P<0.05；但蛇床子素高、中兩組EL相比，P>0.05。

2.2 蛇床子素對VD大鼠海馬組織中IL-1β、caspase-1、IL-18、NLRP3的mRNA和蛋白表達(dá)的影響

PCR結(jié)果顯示（見表1），VD組海馬中IL-1β、caspase-1、IL-18和NLRP3 mRNA的表達(dá)較假手術(shù)組增加；蛇床子素各組與VD組相比，可明顯抑制以上所述mRNA的表達(dá)量，P<0.05。

表1 各組大鼠IL-1β、caspase-1、IL-18和NLRP3 mRNA的相對表達(dá)量

通過Western blot實(shí)驗(yàn)（見表2），VD組較假手術(shù)組海馬中IL-1β、caspase-1、IL-18和NLRP3蛋白表達(dá)增加。同時，低劑量組海馬中的上述蛋白的表達(dá)與VD組相比均減少，而中、高兩組減少地更明顯，P<0.05。

表2 各組大鼠IL-1β、caspase-1、IL-18和NLRP3蛋白的相對表達(dá)量

3 討論

研究報道，在正常細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中，NLRP3會抑制其自身的寡聚化，而被細(xì)菌、病毒、ATP、β淀粉樣蛋白、活性氧等多種內(nèi)外因素干擾后，NLRP3被激活。NLRP3激活后Caspase-1前體可被ASC（一類蛋白質(zhì)）所募集，可進(jìn)一步活化Caspase-1，促使IL-1β、IL-18等關(guān)鍵性致炎因子的成熟，并且其他免疫細(xì)胞被喚醒，進(jìn)而增加趨化等下游因子活性，最終加劇炎性反應(yīng)，引起焦亡[5]。在生理情況下，細(xì)胞焦亡是機(jī)體受到外界病原體刺激或自身內(nèi)源性損傷后引發(fā)的一種免疫防御，它能夠高效拮抗和清除內(nèi)、外病原損傷刺激[6]。但是VD可被長時程的、過度的細(xì)胞焦亡誘導(dǎo)發(fā)病[7]。

據(jù)文獻(xiàn)報道，天然香豆素類化合物及合成的衍生物是一類新型的神經(jīng)保護(hù)劑，有抗氧化性，能抑制并除去ROS（活性氧），減輕氧自由基引起的損害等[8]。蛇床子素如前所述是一種呋喃香豆素。Zhang X Q等[9]研究顯示，蛇床子素能增加SOD的活性，減少丙二醛（MDA）和NO的產(chǎn)生。Chen Z等[10]的研究證實(shí)，蛇床子素可激活Nrf2/HO-1信號通路。本研究發(fā)現(xiàn)，蛇床子素能改善VD大鼠的認(rèn)知行為功能，且能降低海馬組織中NLRP3、IL-1β、caspase-1和IL-18蛋白和mRNA的表達(dá)。故推測，VD大鼠認(rèn)知行為的改善可能是由蛇床子素通過抑制NLRP3炎癥體激活所致。其具體的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究，但本研究為蛇床子素在VD治療中發(fā)揮作用提供了新的思路和實(shí)驗(yàn)證據(jù)。