基于超高效液相色譜-質譜聯(lián)用技術和化學計量學方法比較白芥子炒制前后的化學成分

賈小舟 楊小龍 盧曉瑩 梁月儀 何民友 陳向東 魏梅 孫冬梅 李振雨

中圖分類號 R284.1 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）22-2731-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.22.08

摘 要 目的：比較白芥子炒制前后的化學成分。方法：采用超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱質譜（UPLC-Q-Exactive Obitrap MS）聯(lián)用技術對白芥子炒制前后的化學成分進行分析。色譜柱為Waters CORTECS T3，流動相為甲醇-0.1%甲酸溶液（梯度洗脫），流速為0.25 mL/min，柱溫為30 ℃，進樣量為2 μL;高分辨MS采用加熱電噴霧離子源，于正離子掃描模式下掃描，掃描范圍為m/z 120～1 000。采用Compound Discover 3.2軟件結合相關數(shù)據(jù)庫等對白芥子炒制前后的化學成分進行鑒定，以峰面積對成分含量變化進行初步評價，再以峰面積為變量對成分含量變化進行化學計量學分析。結果：從白芥子中共鑒定出54種化學成分，主要為脂肪酸類（以芥子酸為代表）、生物堿類（以芥子堿為代表）、黃酮類等化合物。經(jīng)炒制后共有19種化學成分的含量發(fā)生了明顯變化，其中10種顯著降低、9種顯著升高（P<0.05）。主成分分析和正交偏最小二乘法判別分析均能將白芥子與炒白芥子明顯區(qū)分開。結論：白芥子經(jīng)炒制后，其部分化學成分含量發(fā)生了明顯變化，這可能是該藥材炒制后功效發(fā)生改變的重要原因之一。

關鍵詞 白芥子;炒制;化學成分;超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱質譜聯(lián)用技術;主成分分析;正交偏最小二乘法判別分析

Comparison of Chemical Constituents of Sinapis alba before and after Stir-frying Based on UPLC-MS and Chemometrics Methods

JIA Xiaozhou1，2，YANG Xiaolong1，LU Xiaoying1，LIANG Yueyi1，HE Minyou1，CHEN Xiangdong1，WEI Mei1，SUN Dongmei1，LI Zhenyu1（1. Guangdong Yifang Pharmaceutical Co.， Ltd./Guangdong Provincial Key Lab of TCM Formula Granules Enterprise， Guangdong Foshan 528244， China; 2. The First Affiliated Hospital of Guangdong University of TCM， Guangzhou 510400， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To compare the chemical components in Sinapis alba before and after stir-frying. METHODS： UPLC-Q-Exactive Obitrap MS was adopted to analyze chemical constituents of S. alba before and after stir-frying. The determination was performed on Waters CORTECS T3 column with mobile phase consisted of methanol-0.1% formic acid solution （gradient elution） at the flow rate of 0.25 mL/min. The column temperature was 30 ℃ and the sample size was 2 μL. High resolution MS adopted heating electrospray electron source， positive ion scanning mode， scanning range m/z 120-1 000. The chemical constituents of S. alba before and after stir-frying were identified by Compound Discover 3.2 software combined with relevant database， and the content changes of chemical constituents were analyzed by using peak area. Chemometrics analysis was performed for the content changes of chemical constituents using peak area as variable. RESULTS： A total of 54 chemical components were identified in S. alba， mainly fatty acids （represented by erucic acid）， alkaloids （represented by sinapine）， flavonoids. After stir-frying， the contents of 19 chemical components changed significantly， of which the contents of 10 components decreased significantly and those of 9 components increased significantly （P<0.05）. Principal component analysis and orthogonal partial least squares discriminant analysis could clearly distinguish S. alba from stir-fried S. alba. CONCLUSIONS： The contents of some chemical components of S. alba change significantly after stir-frying， which may be one of the important reasons for the change of efficacy after stir-frying.

KEYWORDS? ?Sinapis sinapis; Stir-frying; Chemical constituents; UPLC-Q-Exactive Obitrap MS; PCA; OPLS-DA

白芥子為十字花科植物白芥Sinapis alba L.的干燥成熟種子，性溫，味辛，歸肺經(jīng)，具有溫肺祛痰、利氣散結、通絡止痛之功效[1]。化學成分研究表明，白芥子含有多糖、揮發(fā)油、脂肪酸、生物堿、黃酮等5大類成分[2]。藥理學研究證實，白芥子中的白芥子苷、脂肪油、芥子堿、芥子酶等成分的辛散力強，可通絡止痛、散結消腫，故臨床廣泛用其治療痰瘀阻絡所致的內科、外科及婦科多種疾病[3]。白芥子中的芥子油（如油酸、芥酸等）有刺鼻的辛辣味及刺激作用，能使皮膚和黏膜發(fā)生水腫、水皰，劑量過大還易引起強烈的胃腸道刺激[2]。因此，臨床上多以白芥子的炒制品配伍入方，可緩和其辛散走竄之性，避免耗氣傷陰，并善于順氣豁痰，用于痰多咳嗽的治療;同時，白芥子經(jīng)炒制后種皮破裂，其有效成分易被煎出，可充分發(fā)揮其利氣散結等功效[4]。

近年來，學界對白芥子的研究多集中在其化學成分和藥理藥效方面[5-10]，尚未見針對白芥子炒制后化學成分變化的分析報道。鑒于此，本研究采用超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱質譜（UPLC-Q-Exactive Obitrap MS）聯(lián)用技術對白芥子炒制后的化學成分進行分析，采用Compound Discover 3.2軟件對其化學成分進行鑒定，并結合化學計量學方法對其炒制前后的化學成分及含量進行比較，以期為揭示白芥子的炒制內涵提供科學依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器有Thermo Vanquish Flex型UPLC-Thermo Fisher QE型高分辨MS聯(lián)用儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）、ME204E型萬分之一電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）、KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、Milli-Q Direct型超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）等。

1.2 主要試劑與藥品

本研究所用的主要試劑有甲醇（MS純，美國Merck公司，批號1122707049）、甲酸（MS純，德國CNW公司，批號A8310050）;其余試劑均為分析純，水為超純水。

本研究共收集白芥子藥材10批（樣品來源信息如表1所示），經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任藥師鑒定，均為十字花科植物白芥S. alba L.的干燥成熟種子。10批炒白芥子飲片按照2020年版《中國藥典》（一部）“芥子”項下飲片炮制規(guī)定進行炮制，具體方法為：取凈白芥子，照清炒法（通則0213）炒至淡黃色至深黃色，有香辣氣，用時搗碎[1]。

2 方法

2.1 供試品溶液的制備

取白芥子和炒白芥子粉末（過三號篩）約0.1 g，精密稱定，分別置于具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定質量，超聲（功率250 W，頻率50 kHz）處理30 min，放冷，再次稱定質量，用50%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2 分析條件

2.2.1 色譜條件 以Waters CORTECS T3（150 mm×2.1 mm，1.6 μm）為色譜柱，以甲醇（A）-0.1%甲酸溶液（B）為流動相進行梯度洗脫（0～13 min，100%B→97%B;13～14 min，97%B→85%B;14～23 min，85%B;23～34 min，85%B→76%B;34～44 min，76%B→55%B;44～50 min，55%B～15%B）;流速為0.25 mL/min;柱溫為30 ℃;進樣量為2 μL[11]。

2.2.2 MS條件 采用加熱電噴霧離子源（HESI），噴霧電壓為3.80 kV，加熱溫度為350 ℃，毛細管溫度為350 ℃;鞘氣流速為35 arb，輔助氣流速為10 arb;分別于正、負離子模式下進行掃描，掃描范圍為m/z 120～1 000;S-lens電壓為50 V;歸一化碰撞能量（NCE）為40 eV。

分別采集正、負離子掃描模式下白芥子與炒白芥子樣品的總離子流圖（TIC），結果發(fā)現(xiàn)，負離子掃描模式下出峰較少，而正離子掃描模式下色譜峰的響應較強，因此后續(xù)的分析選擇在正離子掃描模式下進行。白芥子和炒白芥子的TIC（正離子掃描模式）分別如圖1、圖2所示。

2.3 數(shù)據(jù)處理

取“2.1”項下供試品溶液適量，按“2.2”項下分析條件進樣分析，采集所有樣品的色譜圖和多級MS圖，采用Compound Discover 3.2軟件對所提取色譜峰的一級和二級MS進行解析，確定目標化合物的精確分子量、質量數(shù)偏差及加合物離子信息，通過與mzCloud數(shù)據(jù)庫、中藥成分高分辨MS OTCML數(shù)據(jù)庫等進行比對，根據(jù)比對結果對白芥子炒制前后的化學成分進行鑒定，以峰面積對成分含量變化進行初步評價，以log2FC[FC即倍數(shù)變化（fold change），表示兩樣品（組）間峰面積的比值]的絕對值大于1且P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。再以峰面積為變量，采用SIMCA 14.1軟件對白芥子炒制前后的離子數(shù)據(jù)進行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA），繪制白芥子炒制前后化學成分含量差異的火山圖，分析白芥子炒制后化學成分及其含量的變化。

3 結果

3.1 化學成分鑒定

筆者查閱文獻[2-4]，并經(jīng)mzCloud數(shù)據(jù)庫、中藥成分高分辨MS OTCML數(shù)據(jù)庫或與對照品比對，一共從白芥子中鑒定出54種化學成分，如表2所示。

由表2可知，本研究鑒定出來的54種化學成分主要為脂肪酸類、生物堿類、黃酮類和其他類化合物。其中，脂肪酸類成分以白芥子的有效成分芥子酸為代表，其保留時間為36.942 min，在正離子掃描模式下的準分子離子峰為m/z 225.060 5[M+H]+，二級MS可見m/z 207.065 2、175.039 0、147.044 1、119.049 4的特征離子;生物堿類成分以芥子堿為代表，其保留時間為23.923 min，在正離子掃描模式下的準分子離子峰為m/z 310.164 6[C16H24NO5]+，二級MS可見m/z 251.091 4、207.065 3、175.065 3、147.044 0、119.049 3的特征離子;其他類成分以麥芽糖為代表，其保留時間為2.213 min，在正離子掃描模式下的準分子離子峰為m/z 360.150 1[M+NH4]+，二級MS可見m/z 85.028 9、127.039 0、145.049 6的特征離子。

本研究采用正離子掃描模式對白芥子炒制前后的化學成分進行分析，通過TIC圖（圖1、圖2）可知，炒制后白芥子中的一些化學成分發(fā)生了變化，如4-乙酰氨基丁酸（成分5）、腺苷酸（成分23）等成分的含量顯著升高，對羥基苯甲醛（成分50）、D-葡萄糖-6-磷酸（成分10）、煙酰胺核苷酸（成分24）等成分的含量顯著降低，這些化學成分含量的變化可能是白芥子炒制后功效發(fā)生改變的重要原因之一。

3.2 白芥子炒制前后化學成分含量的PCA結果

采用SIMCA 14.1軟件對白芥子炒制前后的化學成分含量進行PCA（其得分圖如圖3所示），可得白芥子和炒白芥子樣品均處于置信區(qū)間內，且兩種樣品被完全分開，說明白芥子和炒白芥子的化學成分含量有較明顯的差異。

3.3 白芥子炒制前后化學成分含量的OPLS-DA結果

OPLS-DA被廣泛應用于代謝組學數(shù)據(jù)的分析，由于其分析方法能夠將組間差異最大化，故常被用于差異代謝物的篩選[12]。筆者采用SIMCA 14.1軟件，對白芥子炒制前后的化學成分含量進行OPLS-DA（其得分圖如圖4所示），并對其進行200次置換檢驗（檢驗結果如圖5所示）。結果可得，所建立的OPLS-DA模型的R2（X）=0.686，R 2（Y）=0.990，Q2=0.967（>0.5），表明該模型可用于白芥子炒制前后化學成分含量的模式識別[13]。

本研究采用OPLS-DA模型中的變量重要性投影（VIP）值進行樣品之間差異代謝物的篩選。根據(jù)每一變量的系數(shù)置信區(qū)間和變量權重的VIP值，可衡量各共有峰的表達模式對樣本分類判別的影響強度和解釋能力：當VIP>1時，表明該變量對所建模型的貢獻率高于平均水平[13]。筆者根據(jù)VIP>1和P<0.05篩選出白芥子炒制前后含量差異有統(tǒng)計學意義的化學成分，以log2FC為橫坐標、以顯著性檢驗P值的負對數(shù)（-log10P）為縱坐標繪制火山圖（圖6），圖中偏離中心越遠的點，表示差異倍數(shù)越大。結果顯示，所鑒定出的54種化學成分中，共有19種的含量發(fā)生了明顯變化：10種化學成分的含量在炒制后顯著降低，9種化學成分的含量在炒制后顯著升高，與炒制前比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），如表2所示。采用SIMCA 14.1軟件對白芥子與炒白芥子的化學成分含量變化進行聚類分析，發(fā)現(xiàn)兩種樣品可被明顯區(qū)分為兩大類，如圖7所示。

4 討論

據(jù)文獻報道，白芥子中主要含有多糖類、揮發(fā)油類、脂肪酸類、生物堿類、黃酮類等化學成分，共有60余種單體化合物得到分離和結構確證[5]。本研究利用UPLC- Q-Exactive Obitrap MS聯(lián)用技術對白芥子炒制前后的化學成分進行分析，并采用Compound Discover 3.2軟件進行鑒定，以mzCloud數(shù)據(jù)庫、中藥成分高分辨MS OTCML數(shù)據(jù)庫及對照品進行對比，從白芥子中共鑒定出54種化學成分，主要為脂肪酸類、生物堿類、黃酮類和其他類化合物，其中有19種成分的含量在炒制后發(fā)生了明顯變化（10種顯著降低、9種顯著升高）。

由本研究結果可推測，4-乙酰氨基丁酸、對羥基苯甲醛等19種化學成分的含量變化可能是增強炒白芥子順氣豁痰等藥效作用的物質基礎;同時，白芥子在炒制過程中有香辣氣溢出，這可能是緩和白芥子的辛散走竄之性、降低其刺激作用的重要原因之一[11];另外，在此次分析中還鑒定出多種氨基酸類成分（如組氨酸、谷氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸等），這些游離氨基酸也可能是影響中藥炒制后成分含量發(fā)生變化的關鍵物質[14]——以上因素可為揭示白芥子的炒制內涵提供科學依據(jù)。但是，本研究僅對白芥子炒制后部分化學成分的變化進行了分析，后續(xù)將進一步對該藥材中其他揮發(fā)性成分進行深入研究。

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（收稿日期：2021-04-26 修回日期：2021-09-23）

（編輯：胡曉霖）