基于炮效關系研究白芥子鎮(zhèn)咳藥效物質基礎

馮寶民，邱 琳，諶啟鵬，王惠國，史麗穎，蔣 革，唐 玲，王永奇，苑艷霞

中藥炮制是體現(xiàn)中醫(yī)用藥特點的主要內容之一，直接關系到臨床用藥的療效。有些藥物必須進行炮制，有效成分才能溶出，有些藥物經(jīng)炮制后，有效成分的溶出率明顯增加，因此，中藥的功效與其炮制方法有著極為密切的聯(lián)系。

白芥子為為十字花科(Cruciferae)芥屬植物白芥Sinapis alba L.的種子，辛，溫，歸肺經(jīng)，臨床入藥常以炒黃法炮制［1］?，F(xiàn)代藥理學研究表明:炒白芥子的鎮(zhèn)咳作用優(yōu)于生白芥子［2-3］，提示炒制法可以提高白芥子鎮(zhèn)咳藥效成分的溶出率。為明確白芥子鎮(zhèn)咳的藥效物質基礎，本研究前期從炒白芥子中分離得到了10個化合物，分別鑒定為4-羥基苯乙酸-2′-醛基-5′-呋喃甲酯(Ⅰ)、對羥苯基乙腈(Ⅱ)、對羥基苯甲醛(Ⅲ)、胡蘿卜苷(Ⅳ)、軟脂酸-1-單甘油酯(Ⅴ)、β-谷甾醇(Ⅵ)、芥子酸(Ⅶ)、對羥基苯甲酸(Ⅷ)、對羥基苯乙酸(Ⅸ)和雙(5-甲酰基糠基)醚(Ⅹ)［4］。HPLC 研究結果顯示，上述成分中，對羥基苯乙腈含量在炒制后明顯增加。對羥基苯乙腈的氰基結構可能在體內經(jīng)過Ⅰ相酶系的作用產(chǎn)生氰化氫(HCN)，從而起到中樞鎮(zhèn)咳作用［5］，因此，本研究擬分離純化對羥基苯乙腈并對其鎮(zhèn)咳作用進行研究，為白芥子炮制機制及白芥子鎮(zhèn)咳活性成分的研究提供實驗依據(jù)。

1 儀器與材料

XT4A顯微熔點測定儀，JEOL JNM-AL400型、Bruker ARX-500型核磁共振儀，JEOL JMS-700型質譜儀，Waters 515高效液相色譜儀，Waters 2487 Dual λ紫外檢測器，Chromstation數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，BP210s 1/1萬電子天平(Sartorius公司)，BP211s 1/10萬電子天平(Sartorius公司)，Laborato 4000型旋轉蒸發(fā)儀(Heidolph公司)，秒表(深圳追日電子公司)。

白芥子購自河北安國，經(jīng)大連大學醫(yī)學院高松副教授鑒定為十字花科植物白芥Sinapis alba L.的干燥成熟種子。氨水(安徽宿州化學試劑廠)，10～40 μm薄層色譜用硅膠、200～300目柱色譜用硅膠(青島海洋化工廠)。

昆明種小白鼠，♀♂各半，體質量(20±2)g，購自大連醫(yī)科大學實驗動物中心。

2 方法

2.1 炒制前后白芥子中對羥基苯乙腈含量的比較

炒白芥子的制備:取凈白芥子，分別用文火加熱5、10 min，炒至表面呈黃色，有爆裂聲，并放出香辣氣味，取出，放涼。

色譜柱條件:色譜柱為Luna 5u Pheny1-Hexy1(250 mm ×4.60 mm，5 μm);流動相為甲醇 -水(35∶65，V/V)流速0.6 ml·min-1;檢測波長287 nm。

標準曲線的繪制:精密稱取對羥基苯乙腈對照品加甲醇溶解并定容至質量濃度分別為10、20、30、40、50 mg·L-1的溶液。精密吸取各溶液 10 μl，注入液相色譜儀，測得進樣濃度(X)對峰面積(Y)的直線回歸方程。

供試品溶液的制備:取生白芥子與5 min炒白芥子、10 min炒白芥子，各20 g，粉碎，石油醚脫脂，過濾，藥渣用0.95乙醇回流提取3次，合并提取液;濃縮至無醇味，得其浸膏，分別精密稱取樣品的浸膏0.1 g，加甲醇溶解并定容至50 ml，得濃度為2 g·L-1的溶液，備用。

樣品測定:分別精密吸取各供試品溶液10 μl，注入液相色譜儀，按上述條件測定，根據(jù)標準曲線的回歸方程求出含量。

2.2 實驗動物的篩選及引咳實驗 動物篩選:將小鼠放入倒置的燒杯內，迅速放入注有1.0 ml濃氨水的棉球，5 s后立即取出，2 min內不咳嗽者舍去。

引咳實驗:在篩選實驗結束7 d后，隨機分組，給藥結束后，將小鼠放在倒置的600 ml的燒杯內，迅速放入注有1.0 ml濃氨水的棉球，一熏一換氨水球，每次熏1只小鼠。記錄放入時間，觀察并記錄咳嗽潛伏期，并記錄2 min內小鼠的咳嗽次數(shù)。

2.3 白芥子炒制前后鎮(zhèn)咳作用比較 實驗動物灌胃給藥。分組及給藥劑量如下:A陰性對照組(蒸餾水0.5 ml·d-1)、B生白芥子組(含4.500 g·kg-1·d-1生白芥子生藥醇提液)、C炒白芥子組(含4.500 g·kg-1·d-1炒白芥子生藥的醇提液)。各組小鼠連續(xù)灌胃給藥7 d，在d 7給藥30 min后，參照“2.2”進行引咳實驗。

2.4 對羥基苯乙腈的制備 取炒白芥子5.0 kg，粉碎，用石油醚(60℃ ～90℃)室溫冷浸脫脂3次(每次24 h)，晾干，以0.95乙醇回流提取，合并提取液，減壓回收乙醇至無醇味，得浸膏733 g;該浸膏加入7 L蒸餾水溶解分散后，依次用1/3體積的醋酸乙酯萃取4次，回收溶劑，得醋酸乙酯萃取物200 g，經(jīng)多次柱色譜分離及重結晶得到對羥基苯乙腈化合物。

2.5 對羥基苯乙腈鎮(zhèn)咳作用研究 實驗動物灌胃給藥。分組及給藥劑量如Tab 3:A炒白芥子組(含4.500 g·kg-1·d-1炒白芥子生藥的醇提液，其中含對羥基苯乙腈0.022 5 g·kg-1·d-1)，B對羥基苯乙腈低劑量組，C對羥基苯乙腈中劑量組，D對羥基苯乙腈高劑量組。在d 7給藥30 min后，參照“2.2”進行引咳實驗。

2.6 統(tǒng)計學處理 所得數(shù)據(jù)用SPSS 10.0軟件處理，首先進行正態(tài)分布及方差齊性檢驗，統(tǒng)計結果表明，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，但方差不齊，故采用近似t檢驗，即 t′檢驗。

3 結果

3.1 炒制前后白芥子中對羥基苯乙腈含量的變化

進樣濃度(X)對峰面積(Y)的直線回歸方程為^Y=5.841×103X+3.573×103，r=0.999 6;線性范圍0.5～2.5 mg。由Tab 1可見白芥子中對羥基苯乙腈含量隨著炒制時間的延長而增加。白芥子炒制5 min后，其中對羥基苯乙腈的含量是生白芥子的5.5倍，白芥子炒制10 min后其中對羥基苯乙腈的含量是生白芥子的7.5倍。

Tab 1 Comparison of p-hydroxyphenylacetonitrile content between fresh and roasted sinapis alba seeds

3.2 炒白芥子與生白芥子鎮(zhèn)咳作用比較 如Tab 2所示，與陰性對照組相比，生白芥子能夠延長實驗動物的咳嗽潛伏期，但抑制實驗動物2 min內咳嗽次數(shù)作用不明顯;炒白芥子具有明確的鎮(zhèn)咳作用。與生白芥子相比，相同劑量情況下，炒白芥子延長實驗動物咳嗽潛伏期、抑制實驗動物2 min內咳嗽次數(shù)的效果均優(yōu)于生白芥子，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

Tab 2 Comparision of antitussive action between fresh and roasted sinapis alba seeds±s，n=20)

Tab 2 Comparision of antitussive action between fresh and roasted sinapis alba seeds±s，n=20)

*P＜0.05 vs negative control group;#P＜0.05 vs fresh seeds of sinapis alba group

Group Dose/g·kg-1·d-1 Cough latent period/s Cough times in 2min A Negative - 6.229±2.274 27.357±9.312 B Fresh sinapis alba seeds 4.500 14.243±3.471* 23.125±8.413 C Roasted sinapis alba seeds 4.500 25.774±6.903*#15.800±3.942*#

3.3 對羥基苯乙腈的制備 200 g醋酸乙酯萃取物經(jīng)多次柱色譜分離及重結晶得到無色棱柱狀結晶，mp 66℃ ～ 67℃ (氯仿)。EI-MS m/z:133［M+］，132，106，105，78，77，51，50，39。1H-NMR(400 MHz，CDCl3)δ:7.15(2H，d，J=8.4 Hz，H-2′，6′)，6.83(2H，d，J=8.4 Hz，H-3′，5′)，5.87(1H，brs，-OH)，3.62(2H，s，H-2)。13C-NMR(100 MHz，CDCl3)δ:155.4(C-4′)，129.1(C-2′，6′)，121.3(C-1′)，118.2(-CN)，115.9(C-3′，5′)，22.9(C-2)。以上數(shù)據(jù)經(jīng)與文獻［6］及 Sadtler光譜［7］中對羥基苯乙腈對照基本一致，故鑒定其為對羥基苯乙腈。

3.4 對羥基苯乙腈鎮(zhèn)咳作用研究 由Tab 3可知，與陰性對照A組相比，對羥基苯乙腈具有明確的鎮(zhèn)咳作用，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。與B炒白芥子組相比，對羥基苯乙腈的低劑量組與炒白芥子鎮(zhèn)咳效果相當，對羥基苯乙腈的中劑量組，其抑制實驗動物2 min內咳嗽次數(shù)效果優(yōu)于炒白芥子，對羥基苯乙腈的高劑量組，其延長實驗動物引喘潛伏期、抑制實驗動物2 min內咳嗽次數(shù)作用均優(yōu)于炒白芥子。

Tab 3 The antitussive effect of p-hydroxyphenylacetonitrile(n=6)

4 討論

中藥炮制工藝是中醫(yī)臨床用藥的一大特色。中藥在炮制過程中發(fā)生了某些成分的變化，因而導致其藥理活性的變化。研究中藥材的炮效關系對于分析中藥藥效物質基礎具有一定的指導意義。

白芥子臨床入藥以炒制法為主，本研究結果顯示，炒白芥子鎮(zhèn)咳活性明顯優(yōu)于生白芥子，這說明炒制法可以提高白芥子中鎮(zhèn)咳藥效成分含量。我們對炒白芥子和生白芥子的化學成分進行對比分析，結果顯示，炒制后對羥基苯乙腈含量明顯增加，白芥子炒制10 min后，其中對羥基苯乙腈含量是炒制前的7.5倍。依據(jù)炮效關系進行分析，對羥基苯乙腈很可能是白芥子鎮(zhèn)咳的藥效成分，本研究在此基礎上，分離純化出對羥基苯乙腈并對其鎮(zhèn)咳作用進行考察，結果發(fā)現(xiàn)，對羥基苯乙腈具有明確的鎮(zhèn)咳作用，其延長實驗動物咳嗽潛伏期、抑制實驗動物2 min內咳嗽次數(shù)效果明顯優(yōu)于空白對照組，可以確定對羥基苯乙腈為白芥子鎮(zhèn)咳藥效成分。對羥基苯乙腈在延長實驗動物咳嗽潛伏期方面具有一定的量效關系，中劑量的對羥基苯乙腈抑制實驗動物2 min內咳嗽次數(shù)作用效果優(yōu)于炒白芥子。高劑量的對羥基苯乙腈鎮(zhèn)咳效果尤為明顯，其延長實驗動物咳嗽潛伏期、抑制2 min內咳嗽次數(shù)效果均優(yōu)于炒白芥子，組間差異有顯著性(P＜0.05)。

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