P2X7受體介導(dǎo)異丙酚對缺氧海馬突觸前膜谷氨酸Ca2+依賴性釋放的抑制作用

劉紅亮，戴體俊

谷氨酸興奮毒性是腦缺血/氧損傷的重要機制，細(xì)胞外液的谷氨酸含量主要由突觸前膜釋放和膠質(zhì)細(xì)胞重攝取決定。以往研究發(fā)現(xiàn)［1］，異丙酚(propofol，P)可促進重攝取功能降低谷氨酸含量而產(chǎn)生腦保護作用。生理狀態(tài)下，突觸前膜釋放谷氨酸通過兩種機制:Ca2+依賴性釋放(囊泡釋放)和Ca2+非依賴性釋放(谷氨酸轉(zhuǎn)運體反向轉(zhuǎn)運)［2］。而缺血/氧時，異丙酚對谷氨酸的兩種釋放機制產(chǎn)生何種作用目前尚不清楚。中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，ATP是一種重要神經(jīng)遞質(zhì)，其離子型受體P2X受體有7種亞型，其中P2X7受體在突觸前膜表達豐富而且在調(diào)節(jié)谷氨酸釋放中發(fā)揮關(guān)鍵作用［3］。缺血/氧時，谷氨酸釋放是否亦受P2X7受體調(diào)控以及異丙酚是否通過作用于突觸前膜P2X7受體而影響谷氨酸釋放均值得研究。因此，本實驗采用海馬突觸前膜缺氧模型，觀察P2X7受體在谷氨酸Ca2+依賴性釋放和Ca2+非依賴性釋放中的作用，異丙酚對谷氨酸釋放的影響及P2X7受體在其中的作用。

1 材料

1.1 實驗藥品與儀器 異丙酚為AstraZeneca公司產(chǎn)品(批號:CFF755);谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、dihydrokainic acid(DHK，谷氨酸轉(zhuǎn)運體抑制劑)、P2X7受體特異性拮抗劑亮藍(lán)G(BBG)及特異性激動劑BZATP為Sigma公司產(chǎn)品;其他試劑均為國產(chǎn)市售分析純。GL20C高速冷凍離心機(中科院武漢科學(xué)儀器廠);HPLC熒光檢測器(美國 Varian公司);SinochromODS 4.6 mm ×250 mm 5 μm C18色譜分析柱(大連依利特科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 實驗動物 Sprague-Dawley♂大鼠，150～200 g，由徐州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。

2 方法

2.1 人工腦脊液(aCSF)的制備 aCSF成分為(mmol·L-1):NaCl 126.5，NaHCO327.5，KCl 2.4，KH2PO40.5，CaCl21.1，MgCl20.83，Na2SO40.5，Glucose 11.8，DHK 0.05，將 pH 值調(diào)至 7.3，用 O2/CO2(95%/5%)充分飽和。用于缺氧缺糖實驗的無糖aCSF，將glucose置換為同等濃度的sucrose，并持續(xù)充以95%N2/5%CO2。用于谷氨酸Ca2+非依賴性釋放試驗時，將Ca2+、DHK從aCSF中去除。

2.2 突觸體的制備 大鼠擊昏斷頭、取腦置于冰面上，分離海馬，按1/10(W/V)加入到0.32 mol·L-1的冷蔗糖溶液中進行勻漿，以1 000×g離心5 min，取上清液再以12 000×g離心20 min，所得沉淀為突觸體，以上步驟在0～4℃操作完成［4］。

2.3 突觸體缺氧缺糖實驗 將制備的突觸體先應(yīng)用aCSF于37℃下孵育20 min，然后移入無糖aCSF中，于37℃下進行缺氧實驗。觀察P2X7受體對谷氨酸釋放的影響時，將突觸體分為4組，假性處理組(Sham，不缺氧缺糖)、對照組(Control，缺氧缺糖)、BBG 組(終濃度 1 μmol·L-1)、BZATP 組(終濃度100 μmol·L-1)。每組分別于缺氧前(基礎(chǔ)值)、缺氧20 min及40 min時收集孵育液測定谷氨酸濃度，谷氨酸Ca2+非依賴性釋放試驗中，將DHK從aCSF中去除。根據(jù)結(jié)果確定下一步實驗。

另將制備的突觸體預(yù)先于37℃下應(yīng)用aCSF孵育20 min，然后移入無糖aCSF中進行缺氧40 min。觀察異丙酚對谷氨酸釋放的影響時，將突觸體隨機分為 6 組，P 0 μmol·L-1組、P 1 μmol·L-1組、P 3 μmol·L-1組、P 10 μmol·L-1組、P 30 μmol·L-1組和P 100 μmol·L-1組(孵育液中分別含異丙酚濃度為 0、1、3、10、30、100 μmol·L-1)。各組在實驗結(jié)束時收集孵育液進行谷氨酸濃度測定并計算異丙酚的半效抑制濃度(IC50)。

觀察P2X7受體在異丙酚抑制效應(yīng)中的作用時，將突觸體分為4組，對照組(Control，缺氧缺糖)、Propofol組(孵育液中含2倍IC50水平的異丙酚)、Propofol+BBG組(孵育液中含2倍IC50水平的異丙酚和 BBG 1 μmol·L-1)及 Propofol+BZATP 組(孵育液中含2倍IC50水平的異丙酚和BZATP 100 μmol·L-1)。各組于缺氧40 min后收集孵育液進行谷氨酸濃度測定。以上實驗組每組含6份突觸體，每份突觸體中蛋白含量為0.26 g·L-1，蛋白含量應(yīng)用考馬斯亮藍(lán)法測定。

2.4 谷氨酸濃度測定 應(yīng)用反相高效液相色譜法(RP-HPLC)測定各實驗組突觸體孵育液中的谷氨酸濃度［5］。具體步驟如下:配制衍生劑:鄰苯二甲醛 27 mg、2-巰基乙醇 40 μl溶于 0.5 ml甲醇中，加入硼酸鈉溶液并調(diào)節(jié)pH值為7.0。取樣本50 μl，衍生劑25 μl，振蕩反應(yīng)1 min 后進樣20 μl。A 流動相為0.5 mol·L-1乙酸鈉(內(nèi)含體積分?jǐn)?shù)為0.05的四氫呋喃)，B流動相為甲醇。洗脫程序為(T，%):(0，32);(7，62);(9，32)，其中 T 為洗脫時間(min)，%為B相在流動相中的濃度。流速0.9 ml·min-1，柱溫38℃。熒光檢測器 λex為360 nm，λem為450 nm。應(yīng)用Prostar工作站進行梯度控制和色譜數(shù)據(jù)處理。應(yīng)用外標(biāo)法計算谷氨酸濃度。谷氨酸突觸體釋放量以每克蛋白(g protein)含有谷氨酸的毫克數(shù)來表示，單位:mg·g-1Pro。

3 結(jié)果

3.1 P2X7受體拮抗劑和激動劑對缺氧海馬突觸前膜谷氨酸釋放的影響 各組于缺氧前的基礎(chǔ)釋放水平差異無顯著性。對照組中，缺氧20 min和40 min時，谷氨酸Ca2+依賴性釋放增高(P＜0.01)。而BBG組中，缺氧不同時點的谷氨酸Ca2+依賴性釋放水平與Sham組比較差異無顯著性(P＞0.05)，與對照組比較則降低(P＜0.01)。BZATP組中，缺氧不同時點谷氨酸Ca2+依賴性釋放水平高于對照組(P＜0.01)。而缺氧不同時點，各組中谷氨酸Ca2+非依賴性釋放無變化，組間差異亦無顯著性(P＞0.05)。見 Tab 1。

3.2 異丙酚對谷氨酸Ca2+依賴性釋放的影響 異丙酚1～100 μmol·L-1可濃度依賴性的抑制缺氧海馬突觸前膜谷氨酸Ca2+依賴性釋放。根據(jù)Hill公式，異丙酚對谷氨酸Ca2+依賴性釋放的IC50為(27.4 ±5.2)μmol·L-1(Tab 2)。

Tab 1Effect of P2X7 receptor antagonist and agonist on glutamate release(mg·g-1Pro，±s，n=6)

Tab 1Effect of P2X7 receptor antagonist and agonist on glutamate release(mg·g-1Pro，±s，n=6)

＊＊P＜0.01 vs sham;##P＜0.01 vs control

Group Ca2+-dependent release Baseline 20 min 40 min Ca2+-independent release Baseline 20 min 40 min Sham 1.20±0.20 1.15±0.28 1.20±0.23 0.51±0.12 0.48±0.13 0.55±0.14 Control 1.15±0.20 2.82±0.27＊＊ 4.07±0.41＊＊ 0.46±0.15 0.50±0.13 0.50±0.14 BBG 1.15±0.25 1.23±0.21## 1.12±0.20## 0.50±0.15 0.50±0.13 0.46±0.15 BZATP 1.16±0.27 5.23±0.42＊＊## 5.10±0.48＊＊##0.47±0.15 0.48±0.15 0.50±0.11

3.3 P2X7受體在異丙酚抑制谷氨酸釋放中的作用 55 μmol·L-1(2倍IC50)異丙酚可抑制缺氧海馬突觸前膜谷氨酸Ca2+依賴性釋放(P＜0.01)，在異丙酚和BBG或異丙酚和BZATP的共同作用下，谷氨酸釋放水平低于對照組(P＜0.01)，但與異丙酚單獨作用比較，差異無顯著性(P＞0.05)，見Tab 3。

Tab 2 Effect of propofol on glutamate release(mg·g-1Pro±s，n=6)

Tab 2 Effect of propofol on glutamate release(mg·g-1Pro±s，n=6)

Group Glutamate release P 0 μmol·L-14.36±.51 P 1 μmol·L-1 4.22 ±0.43 P 3 μmol·L-1 3.86 ±0.40 P 10 μmol·L-1 2.46 ±0.23 P 30 μmol·L-1 1.30 ±0.20 P 100 μmol·L-11.20±0.19

Tab 3 Role of P2X7 receptor in the inhibitory effect of propofol±s，n=6)

Tab 3 Role of P2X7 receptor in the inhibitory effect of propofol±s，n=6)

＊＊P＜0.01 vs control

Group Glutamate release/mg·g-1Pro Control 4.21±0.60 Propofol 1.29±0.19＊＊Propofol+BBG 1.24±0.20＊＊Propofol+BZATP 1.28±0.23＊＊

Fig 1 Standard chromatograph of Glu(10 mg·L－1)and GABA(10 mg·L－1)in RP-HPLC

Fig 2 Chromatograph of Glu and GABA in sample in RP-HPLC

4 討論

突觸前膜釋放谷氨酸有兩種機制:Ca2+依賴性釋放即量子式囊泡釋放和Ca2+非依賴性釋放即由突觸前膜的谷氨酸轉(zhuǎn)運體反向轉(zhuǎn)運而釋放［2］。本實驗結(jié)果表明，在缺氧條件下，谷氨酸的釋放為Ca2+依賴性，而且這種釋放由突觸前膜P2X7受體介導(dǎo)。P2X7受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)分布廣泛，尤其在突觸前膜表達豐富。P2X7受體被其內(nèi)源性配體ATP激活后，離子通道開放而使得Ca2+、Na2+內(nèi)流，引起突觸前膜去極化［7］。ATP作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)一種重要神經(jīng)遞質(zhì)，生理狀態(tài)下通過突觸前膜P2X7受體調(diào)節(jié)其他神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和功能［8］。BZATP是人工合成的P2X7受體特異性激動劑，在研究P2X7受體功能時是一種重要的工具藥。本實驗中，P2X7受體特異性拮抗劑BBG可完全拮抗缺氧時谷氨酸的釋放，而特異性激動劑BZATP可進一步使谷氨酸釋放增加，表明缺氧條件下，激活P2X7受體可促使谷氨酸釋放。

靜脈麻醉藥異丙酚對腦缺血損傷具有保護作用［9］，但亦有研究發(fā)現(xiàn)異丙酚對大鼠皮層和海馬腦片谷氨酸引起的損傷無影響［10］，本實驗發(fā)現(xiàn)異丙酚可濃度依賴性的抑制缺氧環(huán)境下突觸前膜谷氨酸Ca2+依賴性釋放。在進行谷氨酸Ca2+依賴性釋放時，在aCSF中加入谷氨酸轉(zhuǎn)運體抑制劑DHK，以排除Ca2+非依賴性釋放和重攝取的影響，使得結(jié)果更具有可靠性。本實驗中異丙酚抑制谷氨酸釋放的IC50為 27.4 μmol·L-1，而異丙酚臨床麻醉濃度的EC50為 2 μmol·L-1(游離濃度)［11］，表明抑制缺氧環(huán)境下突觸前膜谷氨酸Ca2+依賴性釋放的濃度遠(yuǎn)高于臨床麻醉所需濃度。而臨床相關(guān)濃度的異丙酚是否可通過其他機制產(chǎn)生腦保護作用尚需進一步研究。

在2倍IC50異丙酚作用下，突觸前膜P2X7受體可被完全抑制，使得加入BBG或BZATP后P2X7受體效應(yīng)無變化。由于突觸前膜體積小，難以應(yīng)用電生理學(xué)測定異丙酚對P2X7電流的影響。但以往研究發(fā)現(xiàn)［12］，異丙酚可抑制巨噬細(xì)胞膜P2X7受體電流，且IC50與本實驗相近。鑒于突觸前膜P2X7受體在谷氨酸Ca2+依賴性釋放中的介導(dǎo)作用，可以認(rèn)為異丙酚抑制缺氧環(huán)境下谷氨酸的Ca2+依賴性釋放是通過抑制突觸前膜P2X7受體來實現(xiàn)的。

總之，突觸前膜P2X7受體介導(dǎo)了缺氧環(huán)境下谷氨酸的Ca2+依賴性釋放，異丙酚可濃度依賴性的抑制谷氨酸Ca2+依賴性釋放且這種效應(yīng)由P2X7受體介導(dǎo)。

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