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    糖尿病大鼠腎臟水通道蛋白-2 mRNA的表達及黃芪的調(diào)節(jié)作用

    2010-11-29 09:24:02何國榮杜冠華
    中國藥理學(xué)通報 2010年9期
    關(guān)鍵詞:小劑量黃芪腎臟

    穆 鑫,袁 霞,康 白,何國榮,杜冠華

    糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一種常見的內(nèi)分泌疾病,常伴有內(nèi)分泌調(diào)節(jié)紊亂及水鈉代謝障礙,腎臟病變尤為突出。以往認(rèn)為糖尿病患者多尿的癥狀是由于高血糖引起的滲透性利尿,而最近研究發(fā)現(xiàn)[1]水通道蛋白也在其尿液濃縮及水代謝失調(diào)過程中發(fā)揮重要作用。在1、2型糖尿病人和糖尿病動物模型中均發(fā)現(xiàn)血管加壓素(AVP)濃度增加數(shù)倍,AVP的增加很可能是機體的一種代償反應(yīng),而水通道蛋白-2(aquaporin-2,AQP-2)是唯一受AVP調(diào)節(jié)的水通道蛋白。更令人感興趣的是糖尿病機體排泌增加的部位和AQP-2存在的部位都是腎臟的集合管,故AQP-2在糖尿病尿液的濃縮過程中的表達引起人們的關(guān)注[2]。

    近年來實驗研究發(fā)現(xiàn)[3]黃芪對糖尿病大鼠精氨酸血管加壓素系統(tǒng)的異常有明顯的改善作用,并可糾正其下丘腦血管加壓素的過度表達,而AQP-2是目前比較明確的唯一的AVP調(diào)節(jié)集合管水通透性的靶分子,黃芪治療糖尿病利水消腫改善糖尿病水平衡代謝紊亂的作用是否與影響AQP-2的分布與表達有關(guān),國內(nèi)外尚未見報道。因此,本實驗旨在研究糖尿病大鼠腎臟集合管中AQP-2 mRNA的表達水平及黃芪對其的影響,揭示黃芪治療糖尿病的分子生物學(xué)機制,為該藥的臨床應(yīng)用提供重要的理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實驗動物 Spragne-Dawley(SD)大鼠,♂,180~220 g,由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供,合格證號:SCXK(京)2007-0001。

    1.1.2 試劑和儀器 鏈脲佐菌素(STZ)購于美國Sigma公司;UNIQ-10柱式總 RNA抽提試劑盒與MMLV第一鏈cDNA合成試劑盒購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;SYPR Green PCR Master Mix購于美國ABI公司;AQP-2 RT-PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成;胰島素放射免疫藥盒購于北京原子高科核技術(shù)應(yīng)用股份有限公司;C肽放射免疫分析試劑盒購于天津協(xié)和醫(yī)藥科技有限公司;黃芪注射液由成都地奧九泓制藥廠生產(chǎn);其他試劑為國產(chǎn)分析純。主要儀器:5700型定量基因分析儀購于美國PE公司;One TouchⅡ血糖測定儀及試紙購于美國Janson and Janson公司;BH6020型組合式γ計數(shù)器購自北京核儀器廠。

    1.2 方法

    1.2.1 糖尿病大鼠模型的制備 SD大鼠禁食12 h后,左下腹腹腔注射鏈脲佐菌素55 mg·kg-1,72 h后用One TouchⅡ血糖測定儀測尾靜脈血糖,血糖在 16.7 mmol·L-1以上者為造模成功[4]。

    1.2.2 分組與給藥 健康♂ SD大鼠40只,按體質(zhì)量隨機分為4組,每組10只。① 糖尿病模型組(DM組);②小劑量黃芪治療組(LD組):糖尿病模型確立后d 2,予以黃芪注射液5 g·kg-1·d-1腹腔注射;③大劑量黃芪治療組(HD組):糖尿病模型確立后d 2,予以黃芪注射液10 g·kg-1·d-1腹腔注射;④正常對照組(NC組)。各組動物均自由飲水、進食,連續(xù)用藥6周,糖尿病模型組大鼠每日腹腔注射等量生理鹽水。

    1.2.3 糖尿病大鼠血糖測定 實驗結(jié)束前用One TouchⅡ血糖測定儀測各組大鼠尾靜脈血糖。

    1.2.4 糖尿病大鼠尿量測定 予大鼠50 ml·kg-1生理鹽水水負(fù)荷,30 min后,逐一擠壓大鼠下腹部排盡余尿,各組給藥后,立即放入代謝籠,收集給藥后24 h尿液。

    1.2.5 取材 末次給藥6 h后用3%戊巴比妥鈉麻醉動物,經(jīng)頸動脈取血約5 ml,室溫靜置約20 min,用離心機以1 500 r·min-1離心15 min,分離血清后于-20℃冷凍保存;在大鼠處死前迅速取出腎臟髓質(zhì)組織標(biāo)本,放入凍存管,立即置于液氮中固定,后轉(zhuǎn)入低溫冰箱-70℃保存。

    1.2.6 血清胰島素、C肽含量測定 按照胰島素放射免疫藥盒、C肽放射免疫分析試劑盒說明書用組合式γ計數(shù)器測定血清樣品中胰島素、C肽的含量。

    1.2.7 RT-PCR檢測AQP-2 mRNA的表達 按照UNIQ-10柱式總RNA抽提試劑盒說明提取總的RNA,按MMLV第1鏈cDNA合成試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄合成第1條鏈cDNA,從每個樣品中取10 μl用于PCR。實時 PCR反應(yīng):10 μl DNA模板、2×SYPR Green PCR Master Mix 25 μl、forward primer 1μl、reverse primer 1 μl、滅菌去離子水補足 50 μl,95℃ 預(yù)變性 3 min,95℃,17 s,61℃,30 s,72℃,0 s,共40 次循環(huán)。AQP-2 forward primer為 5′-GACTGTGCTTAGTGCATCTCATTTTAT-3′,reverse primer 為 5′-AGGATCATGCAAACTCTGTTCGT-3′,擴增長度為 91 bp。β-actin forward primer:5′-CCTGTGGCATCCATGAAACTAC-3′,reverse primer:5′-CTTCTGCATCCTGTCAGCGAT-3′,擴增片段長度為134 bp。

    2 結(jié)果

    2.1 黃芪對糖尿病大鼠血糖的影響 糖尿病模型組、小劑量與大劑量黃芪治療組大鼠血糖均明顯高于正常對照組(P<0.05),小劑量與大劑量黃芪治療組大鼠血糖雖較模型組有所降低,但差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見Tab 1。

    Tab 1 Effect of astragalus membranaceus on blood glucose in rats with diabetes mellitus(±s,n=10)

    Tab 1 Effect of astragalus membranaceus on blood glucose in rats with diabetes mellitus(±s,n=10)

    *P<0.05 vs NC group

    Group Blood glucose/mmol·L -1 NC 6.88±0.94 DM 21.99±3.13*LD 20.40±2.44*HD 19.27±1.44*

    2.2 黃芪對糖尿病大鼠血清胰島素、C肽的影響

    糖尿病模型組、小劑量黃芪治療組與大劑量黃芪治療組大鼠血清胰島素、C肽水平均明顯低于正常對照組(P<0.05),小劑量與大劑量黃芪治療組大鼠血清胰島素、C肽水平雖較模型組有所增高,但差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見Tab 2。

    Tab 2 Effects of astragalus membranaceus on the levels of serum insulin and C-Peptide in rats with diabetes mellitus±s,n=10)

    Tab 2 Effects of astragalus membranaceus on the levels of serum insulin and C-Peptide in rats with diabetes mellitus±s,n=10)

    *P<0.05 vs NC group

    Group Insulin/mIU·L-1 C-Peptide/μg·L -1 NC 51.60±7.89 0.25±0.07 DM 29.25±5.05* 0.13±0.04*LD 30.48±2.77* 0.14±0.03*HD 33.94±4.25* 0.16±0.04*

    2.3 黃芪對糖尿病大鼠尿量的影響 糖尿病模型組、小劑量黃芪治療組與大劑量黃芪治療組大鼠尿量均明顯高于正常對照組(P<0.05),實驗結(jié)束時,小劑量與大劑量黃芪治療組大鼠尿量高于糖尿病模型組,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見Tab 3。

    Tab 3 Effect of astragalus membranaceus on urinary volume in rats with diabetes mellitus(±s,n=10)

    Tab 3 Effect of astragalus membranaceus on urinary volume in rats with diabetes mellitus(±s,n=10)

    *P<0.05 vs NC group;#P<0.05 vs DM group

    Group Urinary volume/ml NC 4.10±1.29 DM 27.10±2.08*LD 31.00±2.79*#HD 35.30±1.89*#

    2.4 黃芪對糖尿病大鼠腎臟AQP-2 mRNA表達的影響 實驗結(jié)果表明,糖尿病模型組大鼠腎髓質(zhì)AQP-2mRNA的表達明顯高于正常對照組(P<0.05),小劑量與大劑量的黃芪治療均可使其表達下調(diào)(P <0.05),見 Tab 4。

    Tab 4 Effect of astragalus membranaceus on mRNA expression of AQP-2 in rats with diabetes mellitus(±s,n=10)

    Tab 4 Effect of astragalus membranaceus on mRNA expression of AQP-2 in rats with diabetes mellitus(±s,n=10)

    *P<0.05 vs NC group;#P<0.05 vs DM group

    Group AQP-2/Ct β-actin/Ct AQP-2/β-actin NC 16.79±1.03 15.97±0.73 1.05±0.05 DM 13.98±0.45 14.75±0.39 0.94±0.02*LD 14.65±0.59 15.30±0.57 0.97±0.01*#HD 15.56±1.20 15.61±0.69 1.00±0.04*#

    3 討論

    STZ能選擇性地?fù)p傷動物胰島β細胞,引起細胞壞死,從而誘發(fā)形成胰島素依賴型糖尿病。胰島素和C肽都是由胰島β細胞分泌,測定血清胰島素和C肽的濃度,可以反映胰島β細胞的功能。本實驗研究顯示,糖尿病組大鼠血糖明顯升高,血清胰島素和C肽水平明顯降低,說明大鼠胰島β細胞功能受損,符合糖尿病大鼠的特點。黃芪注射液為傳統(tǒng)中藥黃芪的提取物的滅菌水溶液,其主要成分為黃芪皂苷類、黃芪多糖、氨基酸及微量元素等,具有益氣固表,利水消腫,補中益氣等功效[5]。黃芪可以緩解多種疾病的水鈉潴留,臨床上常用于糖尿病的輔助治療。本實驗研究發(fā)現(xiàn),糖尿病大鼠經(jīng)黃芪治療后,血糖水平有所降低,血清胰島素和C肽水平都有所升高,但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義,推測與用藥劑量、用藥時間有關(guān),單用黃芪降糖效果并不明顯,故臨床上應(yīng)常與胰島素或其他藥物聯(lián)合應(yīng)用,效果更佳。

    腎臟集合管是尿液分泌的最后決定性部位,AQP-2在集合管主細胞上表達豐富,對腎臟濃縮功能起重要的作用[6]。AQP-2的表達主要受AVP調(diào)節(jié),當(dāng)AVP釋放入循環(huán)后,AVP與主細胞管周膜上受體結(jié)合,使主細胞內(nèi)cAMP增高,后者激活cAMP依賴的蛋白激酶A(PKA),將AQP-2蛋白磷酸化,觸發(fā)AQP-2由胞質(zhì)囊泡向管腔膜轉(zhuǎn)移,致使集合管對水通透性增加,即短期調(diào)節(jié)機制。如AVP水平持續(xù)升高數(shù)小時或更長時間,可激活cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB),促使AQP-2基因活化,表現(xiàn)為AQP-2 mRNA和蛋白表達增強,即長期調(diào)節(jié)機制。在糖尿病大鼠體內(nèi)AVP的濃度是增高的,這是機體的一種代償反應(yīng),可以通過對AQP-2的調(diào)節(jié),增加集合管對水的重吸收,在糖尿病早期可減少尿量。在糖尿病晚期,機體處于失代償狀態(tài),回吸收水分雖然增多,但尿量依然增加。與以往的研究一致[7-10],本實驗研究發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠尿量增多,腎臟AQP-2 mRNA表達增加,AQP-2 mRNA表達的增加應(yīng)屬于AVP對AQP-2的長期調(diào)節(jié)。

    糖尿病早期即出現(xiàn)腎臟高血壓、高灌注、高濾過等血流動力學(xué)異常,對腎臟的損害尤為嚴(yán)重,常因大量蛋白尿漏出、低蛋白血癥出現(xiàn)高度浮腫,利尿藥長期服用易引起電解質(zhì)紊亂,低蛋白血癥對利尿藥不敏感,輸注白蛋白制劑價格昂貴,利尿作用短暫,療效均不滿意。本實驗在注射STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型中發(fā)現(xiàn)腎髓質(zhì)AQP-2 mRNA的表達明顯上調(diào),黃芪治療可有效降低腎髓質(zhì)AQP-2 mRNA的表達,緩解糖尿病的水鈉潴留,其機制可能為:在糖尿病中,腎組織中的腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)興奮性增高[11],而黃芪則能抑制RAS系統(tǒng)。RAS興奮是引起血AVP濃度升高的途徑之一,因此推測黃芪是通過抑制RAS來降低血AVP濃度從而降低腎臟AQP-2的表達。目前普遍認(rèn)為黃芪治療糖尿病利水消腫的功效與其減少尿蛋白的排出、提高血漿白蛋白及恢復(fù)腎組織對心鈉素的敏感性有關(guān),但本研究發(fā)現(xiàn)黃芪可下調(diào)腎髓質(zhì)AQP-2 mRNA的表達,增加水的排出,提示黃芪利水消腫并不完全靠這一機制,也可能部分與AQP-2的下調(diào)有關(guān)。因此,黃芪可能通過對AQP-2表達的影響直接調(diào)控集合管水通透性,避免了利尿藥等藥物引起的電解質(zhì)代謝紊亂,其應(yīng)用價值主要是與某些抗糖尿病藥物合用(如胰島素、磺脲類、羅格列酮等),對抗其鈉水潴留的副作用,為臨床用藥提供多種選擇。

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