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    基于網(wǎng)絡(luò)藥理學和細胞分子生物學探討雞血藤治療宮頸癌的作用機制

    2021-12-10 04:16:48田崇梅趙亞萍傅利萍
    浙江中醫(yī)藥大學學報 2021年11期
    關(guān)鍵詞:雞血藤提物靶點

    田崇梅 趙亞萍 傅利萍

    浙江中醫(yī)藥大學附屬紹興中醫(yī)院 浙江,紹興 312000

    宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤,主要病因為高危型人類乳頭狀瘤病毒(human papilloma virus,HPV)持續(xù)感染,常見鱗癌、腺癌和腺鱗癌三種類型,可發(fā)生直接蔓延或淋巴轉(zhuǎn)移[1]。目前臨床上的治療方式主要為手術(shù)治療和放化療,但副作用很大,常引起惡心、嘔吐、腹瀉等不良反應[2]。因此,探究宮頸癌發(fā)病機制,開發(fā)治療宮頸癌的天然新藥,具有非常重要的臨床意義。

    雞血藤是我國的傳統(tǒng)中藥,來源于豆科植物密花豆(Spatholobus suberectus Dunn)的干燥藤莖。中國藥典(2020年版)記載,雞血藤具有活血、補血、調(diào)經(jīng)、舒筋活絡(luò)等功效,可用于婦科疾病中的月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)、血虛萎黃等癥。此外,雞血藤具有抗癌作用,能夠誘導直腸癌細胞凋亡,誘發(fā)氧化應激反應[3],但雞血藤對宮頸癌的作用鮮有報道。本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法,通過篩選雞血藤的有效成分,擬闡明雞血藤抗宮頸癌的作用機制,并通過細胞分子生物學實驗進行驗證,為其臨床應用提供理論基礎(chǔ)。

    1 材料和方法

    1.1 數(shù)據(jù)庫與軟件 (1)中藥藥理學系統(tǒng)分析平臺(Traditional Chinese Medicine Database and Analysis Platform,TCMSP)數(shù)據(jù)庫:http://tcmspw.com/tcmsp.php;(2)基因組注釋數(shù)據(jù)平臺 (genome annotation database platform,GeneCard):http://www.genecards.org/;(3)UniProt數(shù)據(jù)庫:https://www.uniprot.org/;(4)Venny工具:http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/;(5)String數(shù)據(jù)庫:https://string-db.org/;(6) 生物學信息注釋數(shù)據(jù)庫(the Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery,DAVID):https://david.ncifcrf.gov/;(7)京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG) 數(shù)據(jù)庫:https://www.kegg.jp/;(8)R語言繪圖工具。

    1.2 細胞株 宮頸癌Hela細胞株購于上海中科院細胞庫(ATCC:28365),培養(yǎng)于含10%胎牛血清的洛斯維·帕克紀念研究所(Roswell Park Memorial Institute 1640,RPMI 1640)培養(yǎng)基中,置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

    1.3 藥品和試劑 雞血藤飲片購于浙江中醫(yī)藥大學中藥飲片廠(批號:191201);胎牛血清購于美國Gibco公司 (批號:10270106);RPMI 1640培養(yǎng)基購于Hyclone公司(批號:AB216694);3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT] 試劑購于美國Sigma公司(批號:1755C459);二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白濃度測定試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳 (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electropheresis,SDS-PAGE)凝膠制備試劑盒均購于康為世紀公司(批號:50206、00271508);胱天蛋白酶3(caspase 3,CASP3)、Bax、B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Vimentin、E-cadherin和β-actin抗體均購于美國Cell Signaling Technology公司 (批號:0001、0013、0031、0002、0011、0015); 熒光二抗IRDye 800 CM Goat anti-Rabbit抗體和IRDye 680 CM Goat anti-Rabbit抗體均購于美國LI-COR公司(批號:C70426-05、C70124-05)。

    1.4 主要儀器 KQ-500DE型超聲儀購于昆山市超聲儀器有限公司;CP153型電子天平為奧豪斯儀器(上海)有限公司產(chǎn)品;FD-1C-80型冷凍干燥機購于北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司;5427R型高速冷凍離心機購于德國Eppendorf公司;CO2培養(yǎng)箱和超凈臺均為美國賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品;Synergy H1MFD型多功能酶標儀購于美國Biotek公司;LI-COR Odyssey型雙色紅外熒光成像系統(tǒng)購于美國LI-COR公司。

    1.5 網(wǎng)絡(luò)藥理學實驗方法

    1.5.1 雞血藤成分預測與篩選 以“雞血藤”作為關(guān)鍵詞,在TCMSP數(shù)據(jù)庫中以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%且 類藥 性 (drug-likeness,DL)≥0.18為條件,篩選雞血藤的有效活性成分。

    1.5.2 關(guān)鍵靶點收集 通過Drugbank數(shù)據(jù)庫篩選雞血藤中有效成分的相關(guān)靶點,并通過UniProt數(shù)據(jù)庫進行整理歸納;通過GeneCards數(shù)據(jù)庫輸入“cervical cancer”(宮頸癌),選擇人類基因,得到其相關(guān)靶點,通過Venny工具將二者取交集,得到交集靶點。

    1.5.3 關(guān)鍵靶點蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及篩選 通過String數(shù)據(jù)庫對雞血藤有效成分與宮頸癌交集關(guān)鍵靶點構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),選擇物種為人類。篩選平均度值 (degree)≥50的節(jié)點,作為雞血藤治療宮頸癌的關(guān)鍵蛋白節(jié)點。

    1.5.4 基因本體(gene ontology,GO)分析 將雞血藤有效成分與宮頸癌交集靶點導入DAVID數(shù)據(jù)庫,選擇物種為人類,進行GO分析。最終設(shè)定閾值P<0.05,篩選出具有顯著性差異的生物過程,用GraphPad Prism 5繪圖。

    1.5.5 KEGG分析 通過KEGG數(shù)據(jù)庫,搜索KEGG mapping中的Search Pathway,輸入雞血藤有效成分與宮頸癌交集靶點,得到雞血藤治療宮頸癌的信號通路圖。

    1.6 細胞分子生物學實驗方法

    1.6.1 細胞增殖率檢測 宮頸癌Hela細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中,以MTT法檢測不同濃度雞血藤醇提物對宮頸癌Hela細胞增殖率的影響。雞血藤醇提物提取條件:藥材粉碎后過4號篩,以80%乙醇,料液比1∶20,功率300W,頻率60kHz,超聲提取25min,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)并冷凍干燥,獲得凍干粉。

    1.6.2 凋亡相關(guān)蛋白表達水平檢測 取對數(shù)生長期宮頸癌Hela細胞,接種于6孔板中,培養(yǎng)24 h后收集各組細胞,提取細胞中總蛋白,通過BCA法測定蛋白濃度,通過電泳分離,將蛋白轉(zhuǎn)移至活化的聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride,PVDF)膜上,隨后將膜封閉于5%脫脂奶粉中,一抗4℃孵育過夜,洗膜3次,每次10min,二抗避光孵育2h,最后顯色,通過Image J 1.41軟件計算各蛋白的相對表達量。

    1.7 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件及Graph-Pad Prism 7.0繪圖軟件進行統(tǒng)計學分析,每次實驗重復3次。計量資料以±s表示,組間比較采用方差分析,進一步兩兩比較采用最小顯著法檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié)果

    2.1 雞血藤有效成分的預測 通過在TCMSP數(shù)據(jù)庫中檢索,以O(shè)B≥30%且DL≥0.18為條件,并刪除靶點≤1的成分,共得到21種化學成分。見表1。

    表1 雞血藤潛在有效成分Tab.1 Potential effective ingredients of Spatholobi Caulis

    2.2 作用靶點預測 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫和Drugbank數(shù)據(jù)庫收集到雞血藤有效成分相關(guān)靶點110個,通過GeneCards數(shù)據(jù)庫分析得到宮頸癌靶點6 662個,通過韋恩圖分析共有100個交互靶點,即得到雞血藤治療宮頸癌的關(guān)鍵靶點。見圖1。

    圖1 雞血藤與宮頸癌靶點韋恩圖Fig.1 Venn diagram of Spatholobi Caulis and cervical cancer targets

    2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將雞血藤有效成分治療宮頸癌的100個關(guān)鍵靶點制成PPI網(wǎng)絡(luò)圖。見圖2。去掉游離靶點,共涉及97個節(jié)點及1 205條邊,平均degree為24.34。這97個靶點相互作用、相互影響,通過多通道、多方面、多維度協(xié)調(diào)的機制治療宮頸癌。

    圖2 雞血藤治療宮頸癌靶點的相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Interaction network of protein targets of Spatholobi Caulis in the treatment of cervical cancer

    如圖3所示,根據(jù)連線多少進行整合分析,得到前30名連線較靠前的靶點,根據(jù)degree≥50條件得出前9個關(guān)鍵蛋白節(jié)點,關(guān)鍵蛋白分別為蛋白激酶B1(protein kinase B1,AKT1)、絲裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1,MAPK1)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)、原癌基因JUN和MYC、CASP3、血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)、 白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、信號傳導與轉(zhuǎn)錄激活因子3 (signal transducer and activator of transcription 3,STAT3),這說明以上靶點基因?qū)τ陔u血藤治療宮頸癌具有非常重要的意義,可作為雞血藤有效成分的作用靶點。

    圖3 雞血藤治療宮頸癌的關(guān)鍵蛋白Fig.3 Key protein of Spatholobi Caulis in the treatment of cervical cancer

    2.4 GO富集分析 細胞生物過程富集基因數(shù)越多,顏色越紅,表明錯誤檢出率(false discovery rate,F(xiàn)DR)越低,相關(guān)性越強。GO富集分析結(jié)果顯示,雞血藤100個潛在靶點基因中GO分析結(jié)果排名較靠前的生物學功能如下:蛋白體的活動、近端啟動子序列特異性脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)結(jié)合、核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)聚合酶Ⅱ特異性、輔因子結(jié)合、血紅素結(jié)合、泛素樣蛋白結(jié)合、核受體活性等。見圖4。由此表明,雞血藤能夠通過參與多種生物學過程抗癌。

    圖4 雞血藤治療宮頸癌靶點的GO分析Fig.4 GO analysis of Spatholobi Caulis in the treatment of cervical cancer

    2.5 KEGG通路富集分析 結(jié)果提示,靶點主要涉及的通路為動脈粥樣硬化晚期糖基化終末化產(chǎn)物(advanced glycation end products,AGE)及晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products,RAGE)信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、乙肝、人巨細胞病毒感染、腫瘤壞死因子和細胞凋亡信號通路等,提示以上通路可能成為深入研究雞血藤抗宮頸癌的重要靶點,且與前列腺癌、直腸癌、胰腺癌、膀胱癌、肝癌等腫瘤關(guān)系密切。見圖5。由此表明,多成分、多靶點、多通路相互調(diào)節(jié)可能是雞血藤抗宮頸癌的作用機制。

    圖5 雞血藤治療宮頸癌靶點的KEGG通路分析Fig.5 KEGG pathways analysis of potential targets of Spatholobi Caulis in the treatment of cervical cancer

    2.6 靶點途徑分析 涉及凋亡的相關(guān)基因為CASP3、CASP8、CASP9、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase,PARP)、Bcl-2、氨基末端轉(zhuǎn)移酶(N-terminal kinase,JNK)、核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB),這些基因在圖中標記為紅色。 見圖6。說明雞血藤抗宮頸癌與細胞凋亡密切相關(guān),該結(jié)果能夠為進一步細胞分子生物學驗證分析提供參考。

    圖6 雞血藤治療宮頸癌靶點相關(guān)通路Fig.6 Related pathways of Spatholobi Caulis in the treatment of cervical cancer

    2.7 細胞分子生物學實驗

    2.7.1 雞血藤醇提物對宮頸癌Hela細胞增殖抑制

    MTT結(jié)果提示,雞血藤醇提物具有抑制宮頸癌Hela細胞增殖的作用,伴隨著濃度的增加,增殖抑制率也顯著增加(P<0.05,P<0.01),半數(shù)抑制濃度(median inhibition concentration,IC50)=62μg·mL-1,提示雞血藤醇提物可抑制宮頸癌Hela細胞的增殖。見圖7。

    圖7 雞血藤醇提物對宮頸癌Hela細胞增殖抑制的影響Fig.7 Inhibitory effects of ethanolic extract of Spatholobi Caulis on proliferation of Hela cells

    2.7.2 雞血藤對凋亡相關(guān)蛋白表達的影響 CASP3、Bcl-2和Bax是細胞凋亡的關(guān)鍵因子[4],雞血藤醇提物處理后宮頸癌Hela細胞CASP3和Bax蛋白表達顯著升高,Bcl-2蛋白表達明顯降低。見圖8。Bcl-2蛋白能夠抑制細胞凋亡,而CASP3和Bax蛋白則促進細胞凋亡,由此可以看出雞血藤醇提物對宮頸癌Hela細胞凋亡具有促進作用。Vimentin和E-cadherin蛋白是與細胞遷移相關(guān)的因子,Vimentin能夠促進細胞遷移,而E-cadherin則抑制細胞遷移[5]。本研究結(jié)果表明,雞血藤醇提物處理后Vimentin蛋白表達明顯降低,而E-cadherin的表達明顯升高。見圖8。因此,雞血藤醇提物通過提高宮頸癌Hela細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達,抑制遷移蛋白的激活,從而誘導宮頸癌Hela細胞凋亡,發(fā)揮抗癌作用。

    圖8 雞血藤醇提物對宮頸癌Hela細胞凋亡蛋白表達的影響Fig.8 Effect of ethanolic extract of Spatholobi Caulis on apoptosis protein expression of Hela cells

    3 討論

    《本草備要》記載雞血藤具有活血補血、調(diào)經(jīng)止痛、舒筋活絡(luò)的功效,用于月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)、經(jīng)閉、風濕痹痛、麻木癱瘓、血虛萎黃的治療。研究證實,雞血藤能夠通過多種藥理機制抑制癌癥,包括抑制炎癥、抗氧化應激、促進細胞凋亡、促進自噬、抗腫瘤轉(zhuǎn)移等[6]。網(wǎng)絡(luò)藥理學是一門重要的新興學科,能夠篩選中藥中的活性成分以及潛在靶點,這恰好與中國傳統(tǒng)中藥多成分、多靶點、多通路協(xié)同發(fā)揮作用的特性相符[7]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學,通過數(shù)據(jù)庫篩選雞血藤抗宮頸癌的有效成分、關(guān)鍵靶點和作用通路,并通過細胞分子生物學實驗驗證雞血藤對宮頸癌Hela細胞凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達的影響,闡明雞血藤抗宮頸癌的可能作用機制。

    本研究首先通過TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選出雞血藤中21種活性成分,這可能成為雞血藤抗宮頸癌的物質(zhì)基礎(chǔ)。有研究報道,雞血藤中的甘草查爾酮A(licochalcone A)和木犀草素(luteolin)對人肺癌A549細胞具有顯著的抑制作用,能夠通過凋亡通路治療非小細胞肺癌[8],這提示雞血藤抗宮頸癌可能與調(diào)節(jié)凋亡通路有關(guān)。本研究通過PPI網(wǎng)絡(luò)篩選出9個與細胞凋亡密切相關(guān)的關(guān)鍵作用靶點,分別為AKT1、MAPK1、EGFR、JUN、MYC、CASP3、VEGFA、IL-6、STAT3。在細胞凋亡中CASP家族扮演著非常重要的角色,相關(guān)基因有CASP3、CASP8、CASP9、Bcl-2等,其中Bcl-2作為自噬反應代表蛋白,參與許多疾病的發(fā)生發(fā)展過程[9-10]。為了深入研究雞血藤抗宮頸癌的分子機制是否與細胞凋亡有關(guān),課題組進一步以體外實驗加以驗證。免疫印跡結(jié)果表明,雞血藤能夠調(diào)控宮頸癌Hela細胞中凋亡相關(guān)基因CASP3、Bcl-2和Bax,遷移相關(guān)基因Vimentin和E-cadherin的蛋白表達,誘導癌細胞凋亡,并抑制其遷移,由此表明雞血藤抗宮頸癌的作用機制與細胞凋亡密切相關(guān),為進一步研究提供了新靶點。

    綜上所述,本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法研究雞血藤抗宮頸癌的作用機制,闡明雞血藤治療宮頸癌是通過多成分、多靶點和多通路發(fā)揮作用,并通過細胞分子生物學實驗證實雞血藤能夠誘導宮頸癌細胞凋亡。本研究結(jié)果為深入研究雞血藤抗宮頸癌提供了實驗基礎(chǔ),并為開發(fā)高效低毒的天然抗癌新藥提供了新思路。

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