模擬高原低氧環(huán)境對小鼠脾臟鐵代謝的影響*

胡佳楠， 姜 輝， 李美琦， 朱 俐， 駱倩倩

(南通大學(xué)特種醫(yī)學(xué)研究院低氧生物醫(yī)學(xué)綜合實驗室， 江蘇 南通 226019)

我國高原面積廣闊，具有極其重要的國防和經(jīng)濟(jì)價值。隨著中國綜合國力的增強(qiáng)，大量平原人正逐漸進(jìn)駐高原，參與當(dāng)?shù)氐慕?jīng)濟(jì)建設(shè)、科學(xué)探險和國防建設(shè)等活動。然而初到高原易產(chǎn)生各種不適，嚴(yán)重時可引起組織臟器病理改變造成機(jī)體損傷甚至死亡[1-3]。低壓低氧是高原環(huán)境的主要特征之一，機(jī)體為了適應(yīng)低氧環(huán)境，通過增加紅細(xì)胞數(shù)量促進(jìn)氧氣的傳輸來抵御低氧環(huán)境。而紅細(xì)胞中的血紅蛋白是保證氧氣運(yùn)輸?shù)闹匾d體。血紅蛋白的生成過程需要大量鐵元素參與[4-6]，機(jī)體中約70%的鐵存儲在紅細(xì)胞內(nèi)的血紅蛋白中。脾臟是回收血液衰老紅細(xì)胞中血紅素鐵重新供于機(jī)體循環(huán)利用的主要場所。因此，脾臟功能不僅對紅細(xì)胞的處理有直接影響，而且脾臟鐵代謝的變化更是對新的血紅蛋白的合成有重要影響。目前已很明確高原低氧可影響血清鐵含量及紅細(xì)胞生成[7，8]，但是目前有關(guān)高原低氧條件下機(jī)體脾臟組織的鐵代謝情況還不十分清楚。

本研究以健康 C57BL/6小鼠為實驗對象，采用低壓低氧動物實驗艙模擬海拔6 000 m高原低氧環(huán)境，通過低壓低氧不同時間(12 h、3 d)與常壓常氧組比較，探討不同低氧時間后紅細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)、脾臟鐵含量及鐵代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)變化情況，旨在探討高原低氧暴露不同時間對脾臟鐵代謝及其相關(guān)指標(biāo)的影響，從紅細(xì)胞清除角度為防治高原紅細(xì)胞增多癥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

低壓低氧動物實驗艙(上海塔望科技有限公司)，全自動血細(xì)胞分析儀(邁瑞B(yǎng)C-5000Vet)，正置光學(xué)顯微鏡(Leica DM4000B)，生化試劑(上海生工生物科技有限公司)，組織鐵染色試劑(Sigma)，HIF-1a抗體(R&D)、TfR1抗體(Thermo)、Fpn抗體(Novusbio)、Ft-L(Abcam)抗體，HE及免疫組化試劑(碧云天生物科技有限公司)。

1.2 實驗動物

SPF級C57BL/6雄性小鼠36只，體重(20±2.0)g，由南通大學(xué)動物實驗中心提供。實驗動物使用許可證號為SYXK(蘇)2020-0029。所有動物實驗均通過南通大學(xué)倫理委員會審核結(jié)果。

1.3 實驗動物分組

按體重隨機(jī)將小鼠分為四組：低壓低氧12 h組(HH-12 h)、 低壓低氧3 d組(HH- 3 d)，并設(shè)同時間點(diǎn)的常壓常氧對照(Nor-12 h和Nor-3 d)，每組9只。

1.4 實驗方法

低壓低氧動物實驗艙參數(shù)設(shè)定為：海拔高度6 000 m，升降速度5 m/s(穩(wěn)定后艙內(nèi)壓力顯示54 kpa，艙內(nèi)氧氣壓力 11 kpa，溫度24.9℃，濕度40%)。將HH組小鼠放置在設(shè)定好參數(shù)的低壓氧艙內(nèi)保證食物和飲用水。低壓低氧艙控制光照比大約12 h∶12 h。Nor組小鼠除了不放置在低壓低氧艙外，其他條件均與HH組小鼠一致。低壓低氧結(jié)束后從艙內(nèi)迅速取出小鼠，用10%水合氯醛麻醉后摘眼球采血，用含EDTA的EP管收集血液。最后進(jìn)行心臟灌注，分離脾臟組織待測。

1.5 紅細(xì)胞相關(guān)參數(shù)檢測

利用全自動血細(xì)胞分析儀檢測各組小鼠血液中紅細(xì)胞數(shù)(red blood cells, RBC)、血紅蛋白含量(hemoglobin, HGB)、紅細(xì)胞壓積(hematocrit, HCT)及平均血紅蛋白量(mean corpuscular hemoglobin, MCH)。

1.6 蘇木素伊紅染色(Hematoxylin eosin staining，HE)和鐵染色

將分離好的脾臟組織放置在4%多聚甲醛過夜固定后，進(jìn)行脫水、浸蠟、包埋、切片。HE染色時用蘇木素對切片染色5 min，伊紅染色50 s，水洗后進(jìn)行脫水和透明；鐵染色時脫蠟復(fù)水后再依次放入1%亞鐵氰化鉀處理30 min，0.3% H2O2處理20 min后用DAB進(jìn)行顯色，最后用蘇木素復(fù)染5 min后水洗再脫水透明。晾干封片后于400倍顯微鏡下拍片觀察。

1.7 免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry, IHC)

取脾臟的石蠟切片脫蠟、復(fù)水后抗原修復(fù)，用DAB試劑盒進(jìn)行染色，一抗4℃孵育過夜，PBS 洗3次，每次5 min；二抗室溫孵育2 h后PBS洗3次，每次5 min；最后滴加新鮮配制的DAB 顯色液顯色15 s，自來水沖洗后蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片后于400倍顯微鏡下拍片觀察。

1.8 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot, WB)

向脾臟組織中加入0.5 ml蛋白裂解液(含蛋白酶抑制劑)進(jìn)行組織勻漿；12 000 r/min離心15 min，取上清用Thermo BCA試劑盒按照說明書測定蛋白濃度。按照30 μg蛋白/樣用溴酚藍(lán)上樣緩沖液配置上樣液進(jìn)行上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，一抗4℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次5 min。二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，每次5 min，加入ECL 發(fā)光液后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光分析，用Image J 軟件對圖片進(jìn)行分析。所有蛋白表達(dá)量均以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 高原低氧不同時間對小鼠紅細(xì)胞相關(guān)參數(shù)的影響

HH-12 h與Nor-12 h組相比，小鼠血液紅細(xì)胞數(shù)(RBC)、血紅蛋白量(HGB)、紅細(xì)胞壓積(HCT)無明顯變化。但隨著高原低氧暴露時間的延長，HH-3 d組小鼠RBC、HGB、HCT均明顯增高，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P均< 0.05)。但各時間點(diǎn)的平均血紅蛋白含量(MCH)沒有明顯變化(表1)。

Tab. 1 Erythrocyte related parameters of mice at different time points of hypobaric hypoxia n=9)

2.2 高原低氧對小鼠脾臟形態(tài)及鐵含量及分布的影響

如圖1所示，與Nor-3 d組相比，高原低氧暴露3 d后小鼠脾臟大小明顯增大，出現(xiàn)充血性腫大，HE染色顯示高原低氧3 d后脾臟的脾竇比常壓常氧小鼠變窄。組織鐵染色結(jié)果顯示，HH-3 d組與Nor-3 d組相比，脾臟紅髓脾索中非血紅素鐵含量明顯增多且分布較廣。

Fig. 1 Themorphological image, HE staining and iron staining of mice spleen

2.3 高原低氧對小鼠脾臟鐵代謝相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖2所示，與Nor-3 d組相比，高原低氧暴露3 d后脾臟低氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1(TfR1)、鐵輸出蛋白(Fpn)表達(dá)均顯著上調(diào)，儲鐵蛋白(Ft-L)表達(dá)顯著降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05，表2)。圖3的免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示TfR1、Fpn和Ft-L主要分布在脾臟紅髓。

Fig. 2 The expression of iron-related proteins in mice spleen

Tab. 2 Quantification of different proteins expression in mice spleen n=9)

Fig. 3 The expression and distribution of iron-related proteins in mice spleen

3 討論

關(guān)于高原低氧引起的紅細(xì)胞增多癥的病因及病理機(jī)制現(xiàn)在還不十分清楚。以往的研究更多的關(guān)注骨髓干細(xì)胞向紅細(xì)分化的過程中產(chǎn)生的一些誘導(dǎo)紅細(xì)分化的因子[9，10]，鮮少有研究關(guān)注高原低氧下RBC的清除情況。脾臟不僅是機(jī)體儲血器官，也對維持RBC的正常數(shù)量和結(jié)構(gòu)起重要作用，脾臟鐵代謝的變化更是對新的HGB的合成有重要影響。本研究重點(diǎn)關(guān)注高原低氧下脾臟對RBC截留及對HGB中鐵的回收情況，以此探討高原低氧下脾臟功能及鐵代謝的變化，幫助我們更好的理解高原低氧下脾臟在高原紅細(xì)胞增多癥中潛在的作用，為高原紅細(xì)胞增多癥的治療提供新的思路。

眾所周知，低氧時機(jī)體可以通過增加RBC數(shù)量及HGB含量來彌補(bǔ)全身組織氧氣供應(yīng)不足，緩解組織缺氧情況[11，12]。本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠在模擬急性高原6 000 m環(huán)境中暴露12 h后血液中RBC、HGB及HCT變化略有上升但沒有統(tǒng)計學(xué)意義。提示我們在高原低氧暴露初期，脾臟作為機(jī)體血庫可向體機(jī)釋放儲存的血液。而暴露3 d后這些指標(biāo)均發(fā)生明顯增加，這與以往的研究報道的結(jié)果一致[13，14]。低氧誘導(dǎo)因子1α在低氧狀態(tài)下呈誘導(dǎo)型表達(dá)，因此檢測組織中HIF-1α的蛋白表達(dá)情況可以反映組織是否處于缺氧狀態(tài)。本研究中小鼠高原低氧暴露3 d后脾臟組織HIF-1α蛋白表達(dá)顯著增加，提示脾臟組織內(nèi)環(huán)境在高原低氧暴露3d后處于缺氧狀態(tài)。

本研究發(fā)現(xiàn)，高原低氧暴露3 d后小鼠脾臟大小明顯增大，這一方面是由于高原低氧暴露后RBC增加促使脾臟儲血增加發(fā)生代償性的充血性腫大；另一方面，高原低氧3 d引起脾臟的超負(fù)荷運(yùn)轉(zhuǎn)也可能是導(dǎo)致其腫大的另一主要原因[15]。高原低氧后機(jī)體RBC的變形能力降低，不易通過脾竇內(nèi)皮細(xì)胞間隙而滯留在脾索中[16，17]。為了清除截留的RBC會有更多的巨噬細(xì)胞募集到脾索中，其結(jié)果也容易造成脾臟體積增大。本研究鐵染色結(jié)果提示高原低氧暴露3 d組脾索中非血紅素鐵含量顯著高于常壓常氧組，也說明高原低氧后脾索中募集了大量巨噬細(xì)胞來清除脾索中截留的RBC。

巨噬細(xì)胞吞噬截留的RBC后將HGB中血紅素通過血紅素加氧酶作用代謝成鐵離子釋放到血液中，再通過與轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)結(jié)合，形成 Tf-Fe 形式后隨血液轉(zhuǎn)運(yùn)，到達(dá)靶細(xì)胞膜時與細(xì)胞膜上的TfR1結(jié)合形成復(fù)合體，被內(nèi)攝進(jìn)入胞內(nèi)后通過內(nèi)吞體膜上的金屬二價轉(zhuǎn)運(yùn)體 1將鐵釋放到細(xì)胞內(nèi)。進(jìn)入胞內(nèi)的鐵一方面被細(xì)胞利用，另一方面可通過鐵輸出蛋白(Fpn)輸出細(xì)胞，多余的鐵則被存儲到Ft-L上[18]。本研究中通過WB檢測脾臟組織的鐵相關(guān)蛋白表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，高原低氧12 h后鐵相關(guān)蛋白均未發(fā)生明顯變化(結(jié)果未顯示)，這與血液學(xué)檢測結(jié)果中RBC、HGB、HCT均未發(fā)生明顯改變一致，提示高原低氧12 h機(jī)體還處于適應(yīng)階段，脾臟鐵代謝情況及血液系統(tǒng)均未發(fā)生明顯改變。但高原低氧暴露3 d后脾臟功能及鐵代謝情況即發(fā)生明顯改變，這些變化比急進(jìn)高原后心臟結(jié)構(gòu)功能變化的時間點(diǎn)(7 d)更早[19]。高原低氧3 d后小鼠脾臟中TfR1和Fpn表達(dá)均顯著高于常壓常氧組，說明高原低氧暴露3 d后脾臟中鐵的動員加速，主要表現(xiàn)為鐵攝入及輸出能力提高。而Ft-L蛋白表達(dá)降低則說明高原低氧后脾臟組織中存儲的鐵明顯減少，這提示高原低氧后脾臟組織將自身存儲的鐵輸出到血液中供給循環(huán)利用以補(bǔ)償高原低氧下新的紅細(xì)胞生成對鐵的需求。進(jìn)一步的免疫組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，TfR1、Fpn及Ft-L的表達(dá)變化主要分布在脾臟紅髓中，說明高原低氧暴露3 d后在脾臟紅髓中巨噬細(xì)胞清理RBC并回收血紅素中的鐵的功能增強(qiáng)。然而高原低氧3 d的鐵染色的結(jié)果顯示被脾臟回收的鐵在脾臟紅髓發(fā)生明顯沉積。這或許是由于鐵含量太多，超出了正常生理轉(zhuǎn)運(yùn)速度。這可能會導(dǎo)致骨髓不能及時獲得從脾臟回收的鐵，引起分化的RBC中HGB功能不全或產(chǎn)生未成熟RBC數(shù)增加，隨高原低氧暴露時間延長有可能引起RBC的病理性增多，甚至發(fā)展成高原紅細(xì)胞增多癥。我們后期的研究也證實高原低氧暴露7 d的脾臟鐵代謝所有指標(biāo)(TfR1、Fpn及Ft-L)結(jié)果均與高原低氧暴露3 d的結(jié)果完全一致。這些結(jié)果提示高原3 d后血液和脾臟鐵代謝發(fā)生明顯改變且持續(xù)較長時間。目前對于更長時間(大于1周)的高原低氧暴露后小鼠血液學(xué)參數(shù)的改變，尤其是RBC方面的相關(guān)參數(shù)有較多報道，但是對于小鼠脾臟鐵代謝的變化報道較少。是否高原低氧暴露后脾臟功能異常(對紅細(xì)胞截留處理增多)是引起骨髓代償性造血增多的初始原因？是否高原低氧引起了脾臟鐵沉積使得骨髓鐵含量不足產(chǎn)生了功能不全的HGB從而引起RBC進(jìn)一步增多緩解組織缺氧，并最終形成高原紅細(xì)胞增多癥？長時間的高原低氧暴露后脾臟鐵代謝功能的持續(xù)異常(脾索持續(xù)高鐵含量暴露)是否是引起巨噬細(xì)胞功能障礙加劇高原紅細(xì)胞增多癥形成的重要原因？這些問題有待后續(xù)進(jìn)一步深入探究。

綜上所述，本實驗較好地用小鼠研究了模擬急進(jìn)高原3 d后血液系統(tǒng)及脾臟鐵代謝均發(fā)生明顯改變，主要表現(xiàn)為血液RBC顯著增加，脾臟截留處理RBC增多，脾索鐵沉積，脾臟組織細(xì)胞內(nèi)鐵攝取和鐵增輸出加，存儲鐵降低。本研究揭示了高原低氧環(huán)境下小鼠脾臟功能改變及鐵代謝異常可能是引起高原低氧暴露下紅細(xì)胞病理性增多甚至造成高原紅細(xì)胞增多癥的主要原因。