游泳訓(xùn)練對(duì)小鼠心肌PKCδ/P66shc蛋白表達(dá)的影響*

謝文杰， 周 剛， 李鵬飛， 楊 帆， 安靜芳， 李 航

(湖南大學(xué)體育學(xué)院, 長(zhǎng)沙 410082)

常規(guī)體育鍛煉可以提高抗氧化能力進(jìn)而促進(jìn)心臟中抗氧化系統(tǒng)增強(qiáng)，減少氧化應(yīng)激對(duì)心臟組織的損害[1,2],尤其在耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練中對(duì)心肌抗氧化酶水平的增加作用更為明顯[3]。然而，過(guò)度運(yùn)動(dòng)也可導(dǎo)致心臟中活性氧(reactive oxygen species, ROS)的過(guò)量產(chǎn)生[4]，這種氧化應(yīng)激反應(yīng)甚至導(dǎo)致心肌氧化損傷。運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的ROS在心肌組織中是促進(jìn)氧化應(yīng)激甚至是氧化損傷的產(chǎn)生，還是促進(jìn)心肌組織中抗氧化酶活性的增加，與運(yùn)動(dòng)的方式、負(fù)荷強(qiáng)度及運(yùn)動(dòng)時(shí)間密切相關(guān)。

早在20世紀(jì)70年代末到80年代初，有關(guān)運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)ROS生成及其潛在作用首度引起關(guān)注[5]。從那以后，大量的研究試圖揭示運(yùn)動(dòng)條件下細(xì)胞中ROS的來(lái)源。最初的一些研究普遍認(rèn)為線(xiàn)粒體是ROS產(chǎn)生的主要部位，但隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)線(xiàn)粒體外的一些酶也在運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)外ROS的增加中發(fā)揮重要作用[6]。如NADPH氧化酶(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NOX)、黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XO)和一氧化氮合酶(NO synthase)等。最近的研究發(fā)現(xiàn)，心肌中一種銜接蛋白，P66Shc，在運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的心肌活性氧生成中起著關(guān)鍵作用。一項(xiàng)急性的大鼠游泳運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)顯示，3小時(shí)運(yùn)動(dòng)后即刻，大鼠心肌細(xì)胞中P66Shc磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)ROS生成[7]。然而，對(duì)于長(zhǎng)期的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練是否增加P66shc蛋白表達(dá)，以及運(yùn)動(dòng)激活p66shc的上游機(jī)制尚不清楚。

有研究表明，在H2O2刺激的COS-7細(xì)胞中可通過(guò)識(shí)別蛋白激酶Cδ(protein kinase Cδ，PKCδ)的Tyr332磷酸化位點(diǎn)并激活PKCδ，并且被激活的PKCδ與P66shc可形成復(fù)合物[8]。因此，PKCδ的激活，可能是調(diào)控心肌P66Shc蛋白的重要信號(hào)途徑。據(jù)此，本研究通過(guò)對(duì)不同強(qiáng)度訓(xùn)練小鼠施加PKCδ抑制劑Rottlerin，揭示長(zhǎng)期耐力訓(xùn)練是否通過(guò)激活PKCδ來(lái)增強(qiáng)P66Shc蛋白表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)ROS的生成。期待通過(guò)本研究的完成，深入了解運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練介導(dǎo)的心肌氧化應(yīng)激機(jī)制，為運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的心肌適應(yīng)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

初始體重在30～35 g的雄性昆明小鼠50只，購(gòu)于：湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(湘)2016-0002。小鼠自由進(jìn)水、飲食，在20～25℃室溫及40%～60%的環(huán)境濕度下飼養(yǎng)，光線(xiàn)：晝夜自然變化。

1.2 動(dòng)物分組與運(yùn)動(dòng)方案

訓(xùn)練模型:小鼠飼養(yǎng)3 d后進(jìn)行適應(yīng)性游泳2 d，每日1次，每次10 min。2 d適應(yīng)性游泳結(jié)束后，將小鼠隨機(jī)分為：對(duì)照組(C組)、負(fù)重游泳組(E組)、負(fù)重游泳+藥物組(ER組)、非負(fù)重游泳組(P組)、非負(fù)重游泳+藥物組(PR組)，10只/組。(1)C組籠內(nèi)自由活動(dòng)，無(wú)運(yùn)動(dòng)負(fù)荷施加。(2)E組、ER組進(jìn)行4周游泳訓(xùn)練，第1周E組、ER組均為無(wú)負(fù)重游泳，前6日訓(xùn)練時(shí)間依次為：15 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、休息。第2周E組、ER組開(kāi)始進(jìn)行負(fù)重游泳，負(fù)重量是其體重的1%，運(yùn)動(dòng)時(shí)間、頻率分別為：60 min/d，6次/周。第3周負(fù)重量增加到其體重的2%，運(yùn)動(dòng)時(shí)間、頻率與第2周相同，運(yùn)動(dòng)中如發(fā)現(xiàn)小鼠有力竭表現(xiàn)(在水下10 s不能上游)撈出水面休息2 min，繼續(xù)訓(xùn)練直至1 h。第4周負(fù)重量增加到其體重的3%，反復(fù)游泳至力竭，直至訓(xùn)練時(shí)間達(dá)到1 h，運(yùn)動(dòng)時(shí)間、頻率與第2周相同。(3)P組、PR組進(jìn)行無(wú)負(fù)重的游泳，第1周P組、PR組，在前6日訓(xùn)練時(shí)間依次為：15 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、休息。第2、3、4周運(yùn)動(dòng)時(shí)間、頻率分別為：60 min/d，6次/周。E組、ER組、P組、PR組進(jìn)行游泳訓(xùn)練的小鼠，游泳時(shí)間均在上午9：00—10：00。(4)ER組、PR組小鼠在最后2次運(yùn)動(dòng)前進(jìn)行腹腔注射PKCδ抑制劑Rottlerin(0.3 mg/kg，購(gòu)于上海圣克魯斯生物技術(shù)公司)。C組、E組、P組進(jìn)行腹腔注射同等劑量生理鹽水。

1.3 樣本的采集與處理

在末次運(yùn)動(dòng)結(jié)束24 h后，腹腔麻醉進(jìn)行解剖取樣。用30 mg/kg的水合氯醛腹腔麻醉后，迅速進(jìn)行左心室取血，10 ml離心管封閉，靜置3 h后離心取上清。取血結(jié)束后迅速取出心臟用0.9%的NaCl溶液清洗表面、剔除結(jié)締組織，濾紙濾干后樣品管封閉，放入液氮，然后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存，以備勻漿。后期將心臟縱向剪為三份，一份用生理鹽水勻漿，用于ROS、MDA、SOD測(cè)定；一份用5 mmol/L PBS勻漿，用于Western blot分析；再一份用1%NP-40裂解液勻漿，用于Co-IP測(cè)定PKCδ和P66shc的結(jié)合。

1.4 測(cè)試指標(biāo)與方法

ROS測(cè)定：采用熒光探針?lè)?DCFH-DA)檢測(cè)，試劑購(gòu)于美國(guó)Sigma-aldrich公司。采用96孔板，檢測(cè)孔每孔吸取20 μl心肌組織勻漿液(約含100 μg蛋白)，每個(gè)樣品添加4份，其中兩孔添加生理鹽水20 μl,另外兩孔添加20 μl混合液(SOD 500 U/ml+catalase 1 000 U/ml)。最后加入DCF工作液60 μl(含10 mol/L DCF、100 μmol/L NADPH)，混勻后避光孵育30 min(37℃)。多功能酶標(biāo)儀測(cè)定OD值，激發(fā)波長(zhǎng)485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)528 nm。超氧化物的生成量=(無(wú)抑制劑添加組-有抑制劑添加組)/蛋白濃度。

心肌SOD活性：采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定。試劑盒購(gòu)于：南京建成生物工程研究所。

心肌MDA檢測(cè)：倍比稀釋TEP原液，取5種不同濃度TEP各100 μl放入標(biāo)準(zhǔn)管。配置混合液 0.375%TBA:5.6%TCA=2∶1，分別向樣品管、空白管、標(biāo)準(zhǔn)管加入3 ml。2%BHT分別取40 μl加入樣品管、空白管、標(biāo)準(zhǔn)管?？瞻坠芗尤?00 μl乙醇。每樣品管中加入100 μl樣品后立即混勻，水浴60 min(水溫95℃)，加入4 ml正丁醇混勻，離心15 min，取上清液測(cè)OD值，波長(zhǎng)532 nm，光徑1 cm。

血清MDA檢測(cè)：方法同心肌組織MDA的檢測(cè)，每管加樣量100 μl血清。

BCA蛋白濃度測(cè)定法，定量心肌組織蛋白：試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所，根據(jù)試劑盒說(shuō)明操作。

小鼠心肌組織中PKCδ、P-PKCδ、P66shc、P-P66shc、Nox2、GADPH的測(cè)定采用蛋白免疫印跡法(western blot)檢測(cè)，免疫共沉淀(Co-IP)實(shí)驗(yàn)測(cè)試PKCδ與P66shc是否形成復(fù)合物。CO-IP實(shí)驗(yàn)方法：(1)取小鼠心肌100 mg左右加入1%NP-40裂解液，10%濃度勻漿；(2)離心機(jī)12 000 r/min，4℃離心，25 min；(3)各樣品取上清500 μl分別加入5 μl一抗，4℃旋轉(zhuǎn)過(guò)夜；(4)每個(gè)樣品分別加入20 μl protein A/G-beads，4℃旋轉(zhuǎn)過(guò)夜；(5)裂解液清洗4次，每次需12 000 r/min、4℃離心，棄上清，沉淀用于blot分析；Western blot實(shí)驗(yàn)方法：(1)配置10%SDS-PAGE分離膠、封閉膠；(2)分別加入Marker和樣品，120 V電泳1.5 h；(3)300 mA轉(zhuǎn)膜1 h；(4)牛奶封閉30 min；(5)加一抗4℃下旋轉(zhuǎn)過(guò)夜；(6)1%TBS-T洗膜；(7)加二抗，室溫下孵育1 h；(8)1%TBS-T洗膜；(9)配置ECL熒光液到轉(zhuǎn)移膜靜置1 min；(10)洗片；(11)ImageJ軟件分析灰度值，用 GAPDH 作為內(nèi)參，蛋白表達(dá)水平=目標(biāo)蛋白條帶灰度值/GADPH條帶灰度值。

PKCδ、P-PKCδ、P66shc、P-P66shc一抗購(gòu)于圣克魯斯生物技術(shù)公司, P-PKCδ測(cè)定Tyr311位點(diǎn)，P-P66shc測(cè)定36位點(diǎn)。Nox2一抗購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司，二抗均購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司。GADPH購(gòu)于杭州賢至生物科技有限公司。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 不同強(qiáng)度游泳訓(xùn)練對(duì)小鼠心肌組織中ROS、血清與心肌MDA含量及SOD活性的影響

與C組相比，E組小鼠心肌組織中ROS水平顯著增加(P<0.01)；PR組小鼠ROS顯著下降(P< 0.01)。與E組小鼠相比，ER組ROS水平顯著下降(P<0.01)，且P組ROS水平明顯低于E組(P< 0.05)。PR組顯著低于E組(P<0.01)；與P組相比，PR組小鼠心肌ROS顯著下降(P<0.01，表1)。

心肌組織中MDA濃度與C組相比，E組顯著增加(P<0.01)。P組、PR組心肌MDA含量明顯低于E組(P<0.01)。血清中MDA濃度變化與C組相比，E組顯著增加(P<0.05，表1)。

與C組相比，E組小鼠心肌SOD活性顯著降低(P<0.01)，ER組顯著性降低(P<0.05)；P組、PR組與C組相比，SOD活性顯著增加(P<0.05)；與E組相比，P組、PR組SOD活性顯著增加(P<0.01，表1)。

2.2 不同強(qiáng)度游泳訓(xùn)練對(duì)小鼠心肌組織中PKCδ、P66shc、P-PKCδTyr311、P-P66shcser36、NOX2蛋白表達(dá)的影響

在長(zhǎng)期不同運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度訓(xùn)練下,小鼠心肌組織PKCδ蛋白表達(dá)及其磷酸化變化如圖1、表2所示。首先，PKCδ蛋白表達(dá)，與C組比較，E組、P組顯著增加(P<0.01)；與E組相比，ER組蛋白表達(dá)顯著性降低(P<0.01)，PR組顯著低于E組(P<0.01)；與P組相比，PR組顯著降低(P<0.01)。其次，P-PKCδ的變化，與C組比較，E組、P組顯著增加(P<0.01)；與E組相比，ER組顯著降低(P<0.01)；PR組顯著低于E組(P<0.01)；與P組相比，PR組顯著降低(P<0.01)。

Tab. 1 Changes of ROS, SOD, MDA in mouse myocardium and MDA in mouse n=10)

Tab. 2 Expressions of PKCδ, P66shc, P-PKCδTyr311, P-P66shcser36, NOX2 protein in mouse myocardial tissues n=10)

在長(zhǎng)期不同運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度訓(xùn)練下，小鼠心肌組織P66shc蛋白表達(dá)及其磷酸化如圖2、表2所示。首先，不同強(qiáng)度下游泳訓(xùn)練小鼠心肌P66shc蛋白表達(dá)，與C組比較，E組較顯著增加(P<0.01)；與E組相比，ER組蛋白水平顯著降低(P<0.05)，P組顯著低于E組(P<0.05)，PR組顯著降低(P<0.01)。其次，P-P66sh變化，與C組比較，E組、P組顯著增加(P<0.01)；與E組相比，ER組顯著降低(P<0.01)；與P組相比，PR組顯著降低(P<0.01)。

在不同強(qiáng)度游泳訓(xùn)練下，小鼠心肌組織中NOX2蛋白表達(dá)如圖3、表2所示。不同強(qiáng)度下游泳訓(xùn)練小鼠心肌NOX2蛋白表達(dá)，與C組相比較，E組顯著增加(P<0.01)，P組也顯著增加(P<0.05)。與E組相比，ER組顯著降低(P<0.05)；與P組相比，PR組顯著降低(P<0.05)。

2.3 小鼠心肌組織中，PKCδ-P66shc的免疫共沉淀(Co-IP)分析

通過(guò)Co-IP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：如圖4、表3所示，當(dāng)P66shc沉淀時(shí)，PKCδ、P66shc的蛋白表達(dá)均可測(cè)到。在不同強(qiáng)度游泳訓(xùn)練下，小鼠心肌組織中PKCδ蛋白表達(dá)，與C組比較，E組顯著性增加(P<0.01)，ER組顯著性降低(P<0.01)；與E組相比，ER組、P組、PR組顯著低于E組(P<0.01)。與P組相比，PR組顯著降低(P<0.01)。P66shc蛋白表達(dá)，與C組比較，E組顯著增加(P<0.01)；同時(shí)，P組也顯著增加(P<0.05)；與E組相比，ER組、P組、PR組顯著低于E組(P<0.01)。與P組相比，PR組顯著降低(P<0.01)。

Fig. 1 Expressions of PKCδ and P-PKCδTyr311 in myocardial tissue

Fig. 2 Expressions of P66shc and P-P66shcser36 in myocardial tissue

Fig. 3 Expressions of NOX2 in myocardial tissue

Tab. 3 Analysis of PKCδ-P66shc co-immunoprecipitation in myocardial tissue n=10)

Fig. 4 The expressions of PKCδ and P66shc were detected by co-immunoprecipitation

當(dāng)沉淀PKCδ時(shí)，如圖4、表3所示，PKCδ、P66shc蛋白表達(dá)均可測(cè)到。小鼠心肌組織中PKCδ蛋白表達(dá)，與C組比較，E組、P組顯著增加(P< 0.01)，PR組顯著降低(P<0.05)。與E組相比，ER組、P組、PR組顯著降低(P<0.01)；與P組相比，PR組顯著降低(P<0.01)。小鼠心肌組織中P66shc蛋白表達(dá)，與C組比較，E組、ER組、P組顯著增加(P<0.01)。與E組相比，ER組、P組、PR組顯著降低(P<0.01)。與P組相比，PR組顯著降低(P<0.05)。

3 討論

P66Shc蛋白(Shc家族成員)是一種生長(zhǎng)因子銜接蛋白，它的磷酸化可促進(jìn)細(xì)胞氧化應(yīng)激的產(chǎn)生。而PKCδ作為蛋白激酶C的一個(gè)關(guān)鍵成員，它可參與許多信號(hào)傳導(dǎo)途徑以調(diào)節(jié)下游蛋白的磷酸化，使其在細(xì)胞中發(fā)揮作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)注射PKCδ抑制劑，從PKCδ/P66shc途徑，探討不同運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度游泳訓(xùn)練對(duì)小鼠心肌ROS生成的影響。研究發(fā)現(xiàn)：長(zhǎng)期游泳訓(xùn)練可導(dǎo)致小鼠心肌組織ROS生成顯著增加，而采用抑制劑Rottlerin阻斷PKCδ/P66shc信號(hào)通路后，小鼠心肌ROS生成顯著降低。并且在此運(yùn)動(dòng)模型下，負(fù)重游泳訓(xùn)練組心肌組織中SOD活性低于對(duì)照組和非負(fù)重游泳訓(xùn)練組。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同強(qiáng)度的游泳訓(xùn)練對(duì)小鼠心肌組織P66Shc的蛋白表達(dá)影響不同。在負(fù)重游泳訓(xùn)練下，心肌P66Shc的蛋白表達(dá)顯著增加，而普通游泳組未見(jiàn)顯著增加，但是P66Shc的磷酸化在兩種強(qiáng)度訓(xùn)練均見(jiàn)明顯增加?？梢?jiàn)，長(zhǎng)期的游泳訓(xùn)練可促進(jìn)P66Shc的磷酸化，而P66Shc蛋白表達(dá)則與運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的大小有關(guān)。僅見(jiàn)少量急性運(yùn)動(dòng)對(duì)P66Shc蛋白影響的報(bào)道，一項(xiàng)急性的3 h游泳訓(xùn)練可顯著增加大鼠心肌細(xì)胞P66Shc的磷酸化[7],另一項(xiàng)小鼠長(zhǎng)時(shí)間跑臺(tái)訓(xùn)練結(jié)果表明，急性運(yùn)動(dòng)會(huì)增加骨骼肌線(xiàn)粒體H2O2的產(chǎn)生，這與P66Shc和FOXO3a蛋白的上調(diào)有關(guān)，提示p66Shc和FOXO3a信號(hào)與運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的H2O2產(chǎn)生的關(guān)聯(lián)可能在急性運(yùn)動(dòng)過(guò)程中調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化應(yīng)激中發(fā)揮作用[9]。而長(zhǎng)期的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)P66Shc蛋白表達(dá)的影響，本研究應(yīng)該是第一次報(bào)道。P66Shc可直接促進(jìn)ROS的生成[10]，P66Shc基因敲除的小鼠的研究顯示，敲除P66Shc基因的小鼠細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的標(biāo)記物減少[11]，小鼠壽命延長(zhǎng)30%，且表現(xiàn)出更好的氧化應(yīng)激處理能力[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，兩種強(qiáng)度的游泳訓(xùn)練均使心肌ROS增加，但負(fù)重游泳訓(xùn)練組的心肌ROS增加量顯著高于非負(fù)重訓(xùn)練組，提示心肌ROS的增加與P66Shc磷酸化有關(guān)，而高強(qiáng)度訓(xùn)練導(dǎo)致的ROS大量生成與P66Shc表達(dá)增加有關(guān)。

PKCδ作為一種新型PKC家族成員，它不僅是調(diào)節(jié)許多細(xì)胞反應(yīng)的信號(hào)激酶，而且在調(diào)節(jié)細(xì)胞反應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中也起到關(guān)鍵作用。已有研究表明，急性力竭運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致PKCδ表達(dá)和磷酸化水平上調(diào)[13]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)給運(yùn)動(dòng)小鼠注射PKCδ的特異性阻斷劑Rottlerin，檢測(cè)PKCδ、P66shc蛋白表達(dá)及PKCδ的Tyr311位點(diǎn)與P66shc的ser36磷酸化位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)兩種強(qiáng)度的游泳訓(xùn)練均可增加心肌細(xì)胞PKCδ蛋白的表達(dá)和磷酸化，在注射PKCδ抑制劑后，訓(xùn)練小鼠的PKCδ的蛋白表達(dá)及磷酸化均受到抑制；并且，前述兩種強(qiáng)度訓(xùn)練引起的P66shc的蛋白表達(dá)與磷酸化均被抑制。為了驗(yàn)證游泳訓(xùn)練下小鼠心肌組織中PKCδ是否直接對(duì)P66shc產(chǎn)生作用，本研究進(jìn)行了PKCδ/P66shc的共免疫沉淀實(shí)驗(yàn)(Co-IP)。結(jié)果表明，長(zhǎng)期游泳可增加心肌PKCδ和P66shc蛋白結(jié)合，且負(fù)重游泳訓(xùn)練組PKCδ/P66shc顯著性高于非負(fù)重游泳組。結(jié)果提示，長(zhǎng)期的游泳訓(xùn)練使心肌PKCδ與P66shc結(jié)合形成復(fù)合物，前述運(yùn)動(dòng)獲得的心肌P66shc蛋白的變化受PKCδ的調(diào)控，心肌細(xì)胞ROS的生成可通過(guò)PKCδ/P66shc途徑產(chǎn)生。

PKCδ不僅對(duì)P66shc具有調(diào)節(jié)作用催化ROS的生成，而且也通過(guò)調(diào)節(jié)NOX促進(jìn)ROS的生成。本研究通過(guò)在PKCδ抑制劑的干預(yù)下測(cè)定運(yùn)動(dòng)小鼠心肌組織中主要的NOX亞型NOX2，發(fā)現(xiàn)兩種強(qiáng)度的訓(xùn)練組NOX2蛋白表達(dá)均顯著增加，而在注射PKCδ抑制后，NOX2蛋白表達(dá)顯著下降，說(shuō)明運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練條件下，PKCδ對(duì)NOX2有調(diào)控作用。我們此前的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，力竭運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致NOX2的催化亞基gp91phox與其結(jié)構(gòu)亞基p47phox形成復(fù)合物[14]，NOX2的激活是通過(guò)p47phox的磷酸化使其發(fā)揮作用。已有研究表明，通過(guò)消除PKCδ-p47phox信號(hào)途徑可有效降低ROS的生成[15]。尤其重要的是，不僅PKCδ可間接作用于NOX2產(chǎn)生ROS，P66shc也可通過(guò)間接作用于NOX2產(chǎn)生ROS。P66shc在促進(jìn)NADPH氧化酶產(chǎn)生ROS主要是在質(zhì)膜上，P66Shc促進(jìn)Rac-1活化并激活NADPH氧化酶以產(chǎn)生ROS[16,17]。

長(zhǎng)期訓(xùn)練運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的細(xì)胞中ROS的生成，可能給細(xì)胞帶來(lái)氧化損傷之弊或增強(qiáng)抗氧化能力之利，這可能與運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的大小有關(guān)。本研究結(jié)果表明，負(fù)重游泳訓(xùn)練組小鼠心肌組織中ROS、心肌MDA、血清MDA水平顯著增加，SOD活性顯著下降，說(shuō)明高強(qiáng)度訓(xùn)練導(dǎo)致的過(guò)量ROS生成致心肌抗氧化能力下降；非負(fù)重游泳組小鼠心肌ROS增加程度明顯低于負(fù)重游泳訓(xùn)練組，且心肌MDA、血清MDA水平與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異，但SOD活性顯著增強(qiáng)。兩種不同強(qiáng)度訓(xùn)練產(chǎn)生的氧化應(yīng)激效應(yīng)完全不一致，尤其是SOD的活性完全相反，推測(cè)與不同強(qiáng)度訓(xùn)練導(dǎo)致的PKCδ/P66shc途徑ROS生成量有關(guān)。反復(fù)的超負(fù)荷訓(xùn)練，超過(guò)一定的閾值強(qiáng)度后，激活PKCδ/P66shc、NOX、XO等途徑，導(dǎo)致ROS過(guò)量生成，使抗氧化酶激活并大量消耗，這可能是高強(qiáng)度訓(xùn)練使SOD相對(duì)減少的原因。相反，大量的研究表明，耐力訓(xùn)練可使細(xì)胞中的SOD活性提高20-112%[18]。在正常生理?xiàng)l件下，ROS通過(guò)改變基因表達(dá)介導(dǎo)一些生理應(yīng)激的適應(yīng)性過(guò)程，這些反應(yīng)分子的信號(hào)傳遞似乎主要是通過(guò)蛋白質(zhì)中特定殘基的靶向修飾來(lái)實(shí)現(xiàn)的[19]，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練導(dǎo)致的SOD活性增強(qiáng)可能與此有關(guān)。

綜上所述，本研究第一次發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期游泳訓(xùn)練，可導(dǎo)致小鼠心肌通過(guò)PKCδ/P66shc信號(hào)途徑產(chǎn)生ROS。高強(qiáng)度游泳訓(xùn)練可顯著增強(qiáng)PKCδ和P66shc蛋白表達(dá)及磷酸化水平，導(dǎo)致ROS大量生成，后續(xù)的氧化應(yīng)激效應(yīng)是抗氧化酶活性下降；低強(qiáng)度游泳訓(xùn)練也增強(qiáng)PKCδ蛋白表達(dá)及磷酸化水平，增強(qiáng)P66shc磷酸化，促進(jìn)小鼠心肌抗氧化酶活性增強(qiáng)，對(duì)ROS清除能力的提高，產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)適應(yīng)。