鹽酸羅哌卡因?qū)侨饬黾?xì)胞增殖、侵襲、凋亡的影響及其機制*

于 鵬， 尹天翔， 羅彩云， 曾 萍

(宜昌市中心人民醫(yī)院麻醉科， 湖北 宜昌 443008)

骨肉瘤是一種常見的惡性骨腫瘤，術(shù)后結(jié)合化療是骨肉瘤的重要治療方式，其顯著改善了患者生存率和預(yù)后，但化療的毒副反應(yīng)和多藥耐藥的產(chǎn)生是局部復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及治療失敗的重要原因[1, 2]。因此研究骨肉瘤化療的耐藥機制，逆轉(zhuǎn)其耐藥對臨床治療有重要意義。近年來研究發(fā)現(xiàn)，部分麻醉藥通過影響腫瘤細(xì)胞的凋亡、增殖、轉(zhuǎn)移而發(fā)揮抗腫瘤作用[3]。對腫瘤術(shù)后化療患者進(jìn)行麻醉處理對治療有一定的輔助作用[4]。鹽酸羅哌卡因是一種新型長效酰胺類局麻藥，其可抑制胃癌細(xì)胞AGS和HG-27的增殖[5]。羅哌卡因能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和結(jié)腸癌皮下瘤的生長[6]。羅哌卡因能夠以劑量和時間依賴性的方式抑制肝癌細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡[7]。Livin是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族成員，骨肉瘤組織Livin高表達(dá)與腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示預(yù)后不良，可作為骨肉瘤的潛在治療靶點及判斷預(yù)后的分子指標(biāo)[8]。RNA干擾下調(diào)Livin基因表達(dá)可有效促進(jìn)耐藥MG-63骨肉瘤細(xì)胞的凋亡，從而增加其對化療藥物的敏感性[9]。然而鹽酸羅哌卡因?qū)侨饬黾捌涫欠裢ㄟ^調(diào)控Livin對骨肉瘤的影響鮮有研究報道。本實驗通過建立骨肉瘤多柔比星耐藥細(xì)胞，研究鹽酸羅哌卡因?qū)ζ湓鲋?、侵襲、凋亡及化療敏感性的影響及其是否與Livin有關(guān)，以期為臨床應(yīng)用提供實驗資料。

1 材料與方法

1.1 材料

骨肉瘤細(xì)胞U2OS購自上?？吕咨锟萍加邢薰荆畸}酸羅哌卡因(國藥準(zhǔn)字H20173027)購自河北一品制藥股份有限公司；多柔比星(國藥準(zhǔn)字H33021980)購自海正輝瑞制藥有限公司；胎牛血清(貨號：SH30071.03，美國Hyclone公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基(貨號31800022：，美國Gibco公司)；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑(貨號：11668019，美國Invitrogen公司)；四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)試劑盒(貨號：JKSJ-1812，德國IBL公司)、二辛可寧酸(bicinchoninic acid，BCA)試劑盒(貨號：40200080-4，美國Bio-world)；SYBR Green熒光定量PCR試劑盒(貨號：218073，德國Qiagen)；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙錠(PI)試劑盒(貨號：120148，北京凱基生物技術(shù)股份有限公司)。P21(貨號：251259，美國Abbiotec)、Cleaved Caspase-3(貨號：abx012079，英國Abbexa)、E-cadherin(貨號：200134，美國Abbiotec)、MMP-2(貨號：250752，美國Abbiotec)、Livin(貨號：251257，美國Abbiotec)、GAPDH(貨號：251330，美國Abbiotec)；山羊抗兔-HRP(貨號：656120，美國Invitrogen公司)。

1.2 骨肉瘤多柔比星耐藥細(xì)胞株的建立

骨肉瘤細(xì)胞U2OS置于含有10 %胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，然后于37℃含有5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，多柔比星是蒽環(huán)類抗生素的原型化合物，臨床常用的腫瘤化療藥物，也是骨肉瘤常用化療藥物，本實驗以多柔比星(Doxorubicin，DOX)為誘導(dǎo)劑，采用逐步增加藥物劑量誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞，最開始用加入0.1 μg/ml的多柔比星培養(yǎng)基，48 h后篩選存活細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)3代后取穩(wěn)定存活細(xì)胞繼續(xù)用加入高濃度的多柔比星培養(yǎng)，添加的多柔比星濃度依次為0.1、1、10、100、200 μg/ml，每種藥物48 h選擇存活細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，均培養(yǎng)3代穩(wěn)定藥性，最后在濃度為200 μg/ml的多柔比星下仍能生長的細(xì)胞即為耐藥細(xì)胞，命名為U2OS/DOX。

1.3 細(xì)胞處理與分組

取對數(shù)生長期U2OS/DOX細(xì)胞，用濃度分別為0、20、50、100 μg/ml的鹽酸羅哌卡因處理U2OS/DOX細(xì)胞，作為不同濃度鹽酸羅哌卡因處理組；分別將0.5 μg的pcDNA3.1質(zhì)粒載體和pcDNA3.1-Livin質(zhì)粒載體用50 μl的培養(yǎng)液稀釋，然后將其和50 μl用培養(yǎng)液稀釋的LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑混合，室溫靜置20 min，將上述混合液加至500 μl含有U2OS/DOX細(xì)胞(5×105cells/ml)的培養(yǎng)板中，轉(zhuǎn)染6 h后再用濃度為100 μg/ml的鹽酸羅哌卡因處理24 h，記為鹽酸羅哌卡因100 μg/ml+pcDNA3.1組、鹽酸羅哌卡因100 μg/ml+pcDNA3.1-Livin組。

1.4 MTT檢測細(xì)胞增殖抑制率及細(xì)胞半數(shù)抑制濃度(IC50)

用濃度為0.1、1、10、100、200 μg/ml多柔比星處理U2OS和U2OS/DOX細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后，分別加入MTT試劑反應(yīng)，然后檢測波長為490 nm的光密度(OD)值。細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-實驗組OD值/空白對照組OD值)×100%。實驗重復(fù)3次。繪制抑制率曲線，計算藥物對細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。計算耐藥指數(shù)(RI)=IC50(U2OS/DOX)/IC50(U2OS)[10]。

不同濃度鹽酸羅哌卡因處理組、鹽酸羅哌卡因100 μg/ml+pcDNA3.1組、鹽酸羅哌卡因100 μg/ml+pcDNA3.1-Livin組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后也按上述方法檢測細(xì)胞增殖抑制率。

1.5 蛋白質(zhì)印跡(Western blot)法檢測P21、Caspase-3、E-cadherin、MMP-2、Livin、t-Livin蛋白表達(dá)

收集各組細(xì)胞，加入RIPA蛋白裂解液提取細(xì)胞蛋白，用BCA方法進(jìn)行定量，然后取40 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠(10%)電泳，轉(zhuǎn)膜后加入一抗、二抗孵育，然后顯影成像，用Quantity One凝膠軟件檢測各條帶灰度值，蛋白表達(dá)水平=目的條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。每個蛋白樣品設(shè)3個重復(fù)。

1.6 克隆形成實驗檢測細(xì)胞克隆形成數(shù)

各組細(xì)胞制成1×104cells/ml的懸液，以每孔100個細(xì)胞接種于六孔板中，每組設(shè)3個復(fù)孔，培養(yǎng)14 d，出現(xiàn)肉眼可見克隆時終止培養(yǎng)，甲醇固定后吉姆薩染色，在顯微鏡下計數(shù)>50個細(xì)胞的集落。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS漂洗2次，與500 μl的結(jié)合緩沖液混勻。先加入10 μl的Annexin V-FITC，再加入5 μl的PI，混勻后避光孵育10 min。用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。每組設(shè)3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.8 Transwell檢測細(xì)胞遷移和侵襲

取200 μl細(xì)胞懸液接種在Transwell小室上室中，下室加入培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h，多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色后在顯微鏡下觀察，并隨機選擇5個視野計數(shù)，取其平均數(shù)即是細(xì)胞遷移數(shù)；用基質(zhì)膠將Transwell小室包被后再按照細(xì)胞遷移實驗步驟操作即是細(xì)胞侵襲數(shù)。

1.9 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測Livin mRNA表達(dá)水平

不同濃度鹽酸羅哌卡因處理組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后提取總RNA，取2 μl RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，Livin以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行定量PCR擴增，循環(huán)條件為95℃變性15 s，60℃退火30 s；72℃延伸30 s，共40個循環(huán)。相對表達(dá)量采用2-△△Ct法計算。Livin mRNA相對表達(dá)量=2-△△Ct，△△Ct=(CtLivin-Ct內(nèi)參)-(Ct對照-Ct內(nèi)參)。Livin上游引物序列：5'-GTCAGTTCCTGCTCCGGTCAA-3'，下游引物序列：5'-GGCTGCGTCTTCCGGTTCTT-3'；β-actin上游引物序列：5'-CTTAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3'，下游引物序列：5'-CTGTCACCTTCACCGTTCCAGTTT-3'。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 骨肉瘤細(xì)胞U2OS及骨肉瘤耐藥細(xì)胞U2OS/DOX對化療藥物多柔比星IC50和耐藥指數(shù)

多柔比星濃度大于1 μg/ml時，骨肉瘤細(xì)胞U2OS增殖抑制率顯著升高，且具有劑量依賴性(P<0.05)；多柔比星濃度大于10 μg/ml時，骨肉瘤細(xì)胞骨肉瘤耐藥細(xì)胞U2OS/DOX增殖抑制率顯著升高，且具有劑量依賴性(P<0.05，圖1)。U2OS和U2OS/DOX細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度分別是1.49± 0.03，119.96±0.11；耐藥指數(shù)為80.51±5.65；U2OS/DOX細(xì)胞較U2OS細(xì)胞耐藥，說明U2OS/DOX為骨肉瘤耐藥細(xì)胞。

Fig. 1 Effects of doxorubicin on the inhibition rate of U2OS and U2OS / DOX cells

2.2 鹽酸羅哌卡因?qū)?xì)胞U2OS/DOX增殖、凋亡的影響

不同濃度鹽酸羅哌卡因處理的U2OS/DOX細(xì)胞中，P21、Cleaved Caspase-3表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞增殖抑制率顯著升高，克隆形成數(shù)顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高，且呈濃度依賴性(P<0.05，圖2，表1)。

Fig. 2 Effects ofropivacaine hydrochloride on U2OS/DOX clone formation, apoptosis and expression of P21 and Cleaved Caspase-3 proteins

2.3 鹽酸羅哌卡因?qū)?xì)胞U2OS/DOX遷移、侵襲的影響

不同濃度鹽酸羅哌卡因處理的U2OS/DOX細(xì)胞中，E-cadherin表達(dá)水平顯著升高，MMP-2表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)顯著降低，且呈濃度依賴性(P<0.05，圖3，表2)。

Fig. 3 Effects ofropivacaine hydrochloride on the expression of E-cadherin and MMP-2 proteins and number of migration and invasion cells in U2OS / DOX cells treated with doxorubicin

Tab. 1 Effects ofropivacaine hydrochloride on U2OS / DOX proliferation and apoptosis

Tab. 2 Effects ofropivacaine hydrochloride on the migration and invasion of U2OS / DOX in cells treated with doxorubicin

2.4 鹽酸羅哌卡因?qū)?xì)胞U2OS/DOX中Livin表達(dá)的影響

不同濃度鹽酸羅哌卡因處理的U2OS/DOX細(xì)胞中Livin蛋白表達(dá)水平顯著降低，t-Livin表達(dá)水平顯著升高，且呈濃度依賴性(P<0.05，圖4，表3)。

Tab. 3 Effect ofropivacaine hydrochloride on the mRNA expression of Livin in U2OS / DOX cells treated by doxorubicin

Fig. 4 Livin protein expression

2.5 過表達(dá)Livin能逆轉(zhuǎn)鹽酸羅哌卡因?qū)?xì)胞U2OS/DOX增殖的抑制作用及凋亡的促進(jìn)作用

與鹽酸羅哌卡因100 μg/ml+pcDNA3.1組相比，鹽酸羅哌卡因100 μg/ml+pcDNA3.1-Livin組U2OS/DOX細(xì)胞中P21、Cleaved Caspase-3表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞抑制率顯著降低，細(xì)胞克隆形成數(shù)顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05，圖5，表4)。

Fig. 5 Overexpression ofLivin can reverse the effects of ropivacaine hydrochloride on U2OS / DOX clone formation, apoptosis and the effects of P21 and Cleaved Caspase-3 protein expression

2.6 過表達(dá)Livin能逆轉(zhuǎn)鹽酸羅哌卡因?qū)?xì)胞U2OS/DOX遷移、侵襲的抑制作用

與鹽酸羅哌卡因100 μg/ml+pcDNA3.1組相比，鹽酸羅哌卡因100 μg/ml+pcDNA3.1-Livin組U2OS/DOX細(xì)胞中Livin表達(dá)水平顯著升高，t-Livin表達(dá)水平顯著降低，E-cadherin表達(dá)水平顯著降低，MMP-2表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)顯著升高(P<0.05，圖6，表5)。

Fig. 6 Expressions of related proteins and detection of migration and invasion cells

Tab. 4 Overexpression of Livin can reverse the inhibitory effect of ropivacaine hydrochloride on cell U2OS / DOX proliferation and promote apoptosis

Tab. 5 Overexpression of Livin can reverse the inhibitory effects of ropivacaine hydrochloride on cell U2OS / DOX migration and invasion

3 討論

骨肉瘤是常見的骨原發(fā)惡性腫瘤，隨著化療等治療方式的進(jìn)步，明顯改善了骨肉瘤患者預(yù)后，但化療耐藥是如今骨肉瘤化療治療的一大問題，逆轉(zhuǎn)其化療耐藥性是提高其療效的關(guān)鍵[11]。以往研究發(fā)現(xiàn)，麻醉藥物可影響腫瘤患者免疫功能及腫瘤患者術(shù)后轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)[12]。據(jù)報道，羅哌卡因可抑制人甲狀腺癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，且呈劑量依賴性[13]。高濃度的羅哌卡因?qū)Y(jié)腸癌和胰腺癌細(xì)胞具有體外抗增殖作用[14]。羅哌卡因可顯著降低結(jié)腸癌細(xì)胞SW480和SW620的活力[15]。他莫昔芬通過增加人骨肉瘤細(xì)胞MG-63對化療藥物多柔比星的敏感性而抑制細(xì)胞增殖[16]。本實驗建立骨肉瘤耐藥細(xì)胞U2OS/DOX后用不同濃度的鹽酸羅哌卡因處理，細(xì)胞增殖抑制率及凋亡率顯著升高，克隆形成數(shù)及遷移、侵襲數(shù)顯著減少； P21、Cleaved Caspase-3、E-cadherin的表達(dá)水平顯著升高， MMP-2表達(dá)水平顯著下降，呈濃度依賴性。P21是細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，其高表達(dá)可阻滯細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞增殖；而Cleaved Caspase-3是凋亡相關(guān)蛋白，其高表達(dá)表明細(xì)胞凋亡增多；E-cadherin是細(xì)胞間質(zhì)相關(guān)蛋白，MMP-2是基質(zhì)金屬蛋白酶，其均影響細(xì)胞遷移侵襲；因此，本實驗結(jié)果說明，鹽酸羅哌卡因可劑量依賴性的抑制U2OS/DOX細(xì)胞增殖、遷移、侵襲，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其可能與調(diào)控相關(guān)蛋白表達(dá)有關(guān)；即鹽酸羅哌卡因增加了骨肉瘤細(xì)胞對多柔比星的敏感性；與在其他腫瘤中相似，也具有抗癌作用。

Livin在骨肉瘤中高表達(dá)，與骨肉瘤的Enncking分期與腫瘤大小顯著相關(guān)，是骨肉瘤患者的獨立預(yù)后因素[17]。敲除Livin可以顯著降低U2OS細(xì)胞的細(xì)胞增殖，集落形成及侵襲和遷移能力，并增強人骨肉瘤細(xì)胞對順鉑的化學(xué)敏感性[18]。沉默Livin通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和自噬，提高了結(jié)腸癌細(xì)胞對5-氟尿嘧啶的敏感性[19]。敲低Livin誘導(dǎo)頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡，并增強了順鉑，5-氟尿嘧啶和多西他賽化療誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[20]。以上研究表明，Livin參與調(diào)控包括骨肉瘤在內(nèi)的多種腫瘤的進(jìn)展及藥物敏感性。Livin是細(xì)胞凋亡抑制劑蛋白家族的成員，該家族抑制多種刺激觸發(fā)的細(xì)胞凋亡；半胱天冬酶可以裂解Livin產(chǎn)生截短的蛋白t-Livin；當(dāng)Livin水平降低時，t-Livin水平便相對升高[21]。本實驗結(jié)果顯示，鹽酸羅哌卡因處理的U2OS/DOX細(xì)胞中Livin表達(dá)水平顯著降低，t-Livin表達(dá)水平升高。提示鹽酸羅哌卡因抗體可調(diào)控U2OS/DOX細(xì)胞中Livin的表達(dá)。此外，本實驗還發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)Livin逆了轉(zhuǎn)鹽酸羅哌卡因?qū)?xì)胞U2OS/DOX惡性生物學(xué)行為的影響。提示，鹽酸羅哌卡因可能通過調(diào)控Livin表達(dá)影響U2OS/DOX細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡。

綜上所述，鹽酸羅哌卡因能明顯抑制對多柔比星具有耐藥性的骨肉瘤細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲，明顯促進(jìn)骨瘤細(xì)胞凋亡，其機制可能與Livin有關(guān)。