于 鵬, 尹天翔, 羅彩云, 曾 萍
(宜昌市中心人民醫(yī)院麻醉科, 湖北 宜昌 443008)
骨肉瘤是一種常見的惡性骨腫瘤,術(shù)后結(jié)合化療是骨肉瘤的重要治療方式,其顯著改善了患者生存率和預(yù)后,但化療的毒副反應(yīng)和多藥耐藥的產(chǎn)生是局部復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及治療失敗的重要原因[1, 2]。因此研究骨肉瘤化療的耐藥機(jī)制,逆轉(zhuǎn)其耐藥對臨床治療有重要意義。近年來研究發(fā)現(xiàn),部分麻醉藥通過影響腫瘤細(xì)胞的凋亡、增殖、轉(zhuǎn)移而發(fā)揮抗腫瘤作用[3]。對腫瘤術(shù)后化療患者進(jìn)行麻醉處理對治療有一定的輔助作用[4]。鹽酸羅哌卡因是一種新型長效酰胺類局麻藥,其可抑制胃癌細(xì)胞AGS和HG-27的增殖[5]。羅哌卡因能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和結(jié)腸癌皮下瘤的生長[6]。羅哌卡因能夠以劑量和時間依賴性的方式抑制肝癌細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡[7]。Livin是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)家族成員,骨肉瘤組織Livin高表達(dá)與腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移密切相關(guān),提示預(yù)后不良,可作為骨肉瘤的潛在治療靶點及判斷預(yù)后的分子指標(biāo)[8]。RNA干擾下調(diào)Livin基因表達(dá)可有效促進(jìn)耐藥MG-63骨肉瘤細(xì)胞的凋亡,從而增加其對化療藥物的敏感性[9]。然而鹽酸羅哌卡因?qū)侨饬黾捌涫欠裢ㄟ^調(diào)控Livin對骨肉瘤的影響鮮有研究報道。本實驗通過建立骨肉瘤多柔比星耐藥細(xì)胞,研究鹽酸羅哌卡因?qū)ζ湓鲋?、侵襲、凋亡及化療敏感性的影響及其是否與Livin有關(guān),以期為臨床應(yīng)用提供實驗資料。
骨肉瘤細(xì)胞U2OS購自上海柯雷生物科技有限公司;鹽酸羅哌卡因(國藥準(zhǔn)字H20173027)購自河北一品制藥股份有限公司;多柔比星(國藥準(zhǔn)字H33021980)購自海正輝瑞制藥有限公司;胎牛血清(貨號:SH30071.03,美國Hyclone公司);RPMI-1640培養(yǎng)基(貨號31800022:,美國Gibco公司);LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑(貨號:11668019,美國Invitrogen公司);四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)試劑盒(貨號:JKSJ-1812,德國IBL公司)、二辛可寧酸(bicinchoninic acid,BCA)試劑盒(貨號:40200080-4,美國Bio-world);SYBR Green熒光定量PCR試劑盒(貨號:218073,德國Qiagen);膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙錠(PI)試劑盒(貨號:120148,北京凱基生物技術(shù)股份有限公司)。P21(貨號:251259,美國Abbiotec)、Cleaved Caspase-3(貨號:abx012079,英國Abbexa)、E-cadherin(貨號:200134,美國Abbiotec)、MMP-2(貨號:250752,美國Abbiotec)、Livin(貨號:251257,美國Abbiotec)、GAPDH(貨號:251330,美國Abbiotec);山羊抗兔-HRP(貨號:656120,美國Invitrogen公司)。
骨肉瘤細(xì)胞U2OS置于含有10 %胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中,然后于37℃含有5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),多柔比星是蒽環(huán)類抗生素的原型化合物,臨床常用的腫瘤化療藥物,也是骨肉瘤常用化療藥物,本實驗以多柔比星(Doxorubicin,DOX)為誘導(dǎo)劑,采用逐步增加藥物劑量誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞,最開始用加入0.1 μg/ml的多柔比星培養(yǎng)基,48 h后篩選存活細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng),培養(yǎng)3代后取穩(wěn)定存活細(xì)胞繼續(xù)用加入高濃度的多柔比星培養(yǎng),添加的多柔比星濃度依次為0.1、1、10、100、200 μg/ml,每種藥物48 h選擇存活細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng),均培養(yǎng)3代穩(wěn)定藥性,最后在濃度為200 μg/ml的多柔比星下仍能生長的細(xì)胞即為耐藥細(xì)胞,命名為U2OS/DOX。
取對數(shù)生長期U2OS/DOX細(xì)胞,用濃度分別為0、20、50、100 μg/ml的鹽酸羅哌卡因處理U2OS/DOX細(xì)胞,作為不同濃度鹽酸羅哌卡因處理組;分別將0.5 μg的pcDNA3.1質(zhì)粒載體和pcDNA3.1-Livin質(zhì)粒載體用50 μl的培養(yǎng)液稀釋,然后將其和50 μl用培養(yǎng)液稀釋的LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑混合,室溫靜置20 min,將上述混合液加至500 μl含有U2OS/DOX細(xì)胞(5×105cells/ml)的培養(yǎng)板中,轉(zhuǎn)染6 h后再用濃度為100 μg/ml的鹽酸羅哌卡因處理24 h,記為鹽酸羅哌卡因100 μg/ml+pcDNA3.1組、鹽酸羅哌卡因100 μg/ml+pcDNA3.1-Livin組。
用濃度為0.1、1、10、100、200 μg/ml多柔比星處理U2OS和U2OS/DOX細(xì)胞,培養(yǎng)48 h后,分別加入MTT試劑反應(yīng),然后檢測波長為490 nm的光密度(OD)值。細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-實驗組OD值/空白對照組OD值)×100%。實驗重復(fù)3次。繪制抑制率曲線,計算藥物對細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。計算耐藥指數(shù)(RI)=IC50(U2OS/DOX)/IC50(U2OS)[10]。
不同濃度鹽酸羅哌卡因處理組、鹽酸羅哌卡因100 μg/ml+pcDNA3.1組、鹽酸羅哌卡因100 μg/ml+pcDNA3.1-Livin組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后也按上述方法檢測細(xì)胞增殖抑制率。
收集各組細(xì)胞,加入RIPA蛋白裂解液提取細(xì)胞蛋白,用BCA方法進(jìn)行定量,然后取40 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠(10%)電泳,轉(zhuǎn)膜后加入一抗、二抗孵育,然后顯影成像,用Quantity One凝膠軟件檢測各條帶灰度值,蛋白表達(dá)水平=目的條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。每個蛋白樣品設(shè)3個重復(fù)。
各組細(xì)胞制成1×104cells/ml的懸液,以每孔100個細(xì)胞接種于六孔板中,每組設(shè)3個復(fù)孔,培養(yǎng)14 d,出現(xiàn)肉眼可見克隆時終止培養(yǎng),甲醇固定后吉姆薩染色,在顯微鏡下計數(shù)>50個細(xì)胞的集落。
收集細(xì)胞,用預(yù)冷的PBS漂洗2次,與500 μl的結(jié)合緩沖液混勻。先加入10 μl的Annexin V-FITC,再加入5 μl的PI,混勻后避光孵育10 min。用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。每組設(shè)3個復(fù)孔,實驗重復(fù)3次。
取200 μl細(xì)胞懸液接種在Transwell小室上室中,下室加入培養(yǎng)液,培養(yǎng)24 h,多聚甲醛固定,結(jié)晶紫染色后在顯微鏡下觀察,并隨機(jī)選擇5個視野計數(shù),取其平均數(shù)即是細(xì)胞遷移數(shù);用基質(zhì)膠將Transwell小室包被后再按照細(xì)胞遷移實驗步驟操作即是細(xì)胞侵襲數(shù)。
不同濃度鹽酸羅哌卡因處理組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后提取總RNA,取2 μl RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,Livin以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增,循環(huán)條件為95℃變性15 s,60℃退火30 s;72℃延伸30 s,共40個循環(huán)。相對表達(dá)量采用2-△△Ct法計算。Livin mRNA相對表達(dá)量=2-△△Ct,△△Ct=(CtLivin-Ct內(nèi)參)-(Ct對照-Ct內(nèi)參)。Livin上游引物序列:5'-GTCAGTTCCTGCTCCGGTCAA-3',下游引物序列:5'-GGCTGCGTCTTCCGGTTCTT-3';β-actin上游引物序列:5'-CTTAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3',下游引物序列:5'-CTGTCACCTTCACCGTTCCAGTTT-3'。
多柔比星濃度大于1 μg/ml時,骨肉瘤細(xì)胞U2OS增殖抑制率顯著升高,且具有劑量依賴性(P<0.05);多柔比星濃度大于10 μg/ml時,骨肉瘤細(xì)胞骨肉瘤耐藥細(xì)胞U2OS/DOX增殖抑制率顯著升高,且具有劑量依賴性(P<0.05,圖1)。U2OS和U2OS/DOX細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度分別是1.49± 0.03,119.96±0.11;耐藥指數(shù)為80.51±5.65;U2OS/DOX細(xì)胞較U2OS細(xì)胞耐藥,說明U2OS/DOX為骨肉瘤耐藥細(xì)胞。
Fig. 1 Effects of doxorubicin on the inhibition rate of U2OS and U2OS / DOX cells
不同濃度鹽酸羅哌卡因處理的U2OS/DOX細(xì)胞中,P21、Cleaved Caspase-3表達(dá)水平顯著升高,細(xì)胞增殖抑制率顯著升高,克隆形成數(shù)顯著降低,細(xì)胞凋亡率顯著升高,且呈濃度依賴性(P<0.05,圖2,表1)。
Fig. 2 Effects ofropivacaine hydrochloride on U2OS/DOX clone formation, apoptosis and expression of P21 and Cleaved Caspase-3 proteins
不同濃度鹽酸羅哌卡因處理的U2OS/DOX細(xì)胞中,E-cadherin表達(dá)水平顯著升高,MMP-2表達(dá)水平顯著降低,細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)顯著降低,且呈濃度依賴性(P<0.05,圖3,表2)。
Fig. 3 Effects ofropivacaine hydrochloride on the expression of E-cadherin and MMP-2 proteins and number of migration and invasion cells in U2OS / DOX cells treated with doxorubicin
Tab. 1 Effects ofropivacaine hydrochloride on U2OS / DOX proliferation and apoptosis
Tab. 2 Effects ofropivacaine hydrochloride on the migration and invasion of U2OS / DOX in cells treated with doxorubicin
不同濃度鹽酸羅哌卡因處理的U2OS/DOX細(xì)胞中Livin蛋白表達(dá)水平顯著降低,t-Livin表達(dá)水平顯著升高,且呈濃度依賴性(P<0.05,圖4,表3)。
Tab. 3 Effect ofropivacaine hydrochloride on the mRNA expression of Livin in U2OS / DOX cells treated by doxorubicin
Fig. 4 Livin protein expression
與鹽酸羅哌卡因100 μg/ml+pcDNA3.1組相比,鹽酸羅哌卡因100 μg/ml+pcDNA3.1-Livin組U2OS/DOX細(xì)胞中P21、Cleaved Caspase-3表達(dá)水平顯著降低,細(xì)胞抑制率顯著降低,細(xì)胞克隆形成數(shù)顯著升高,細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05,圖5,表4)。
Fig. 5 Overexpression ofLivin can reverse the effects of ropivacaine hydrochloride on U2OS / DOX clone formation, apoptosis and the effects of P21 and Cleaved Caspase-3 protein expression
與鹽酸羅哌卡因100 μg/ml+pcDNA3.1組相比,鹽酸羅哌卡因100 μg/ml+pcDNA3.1-Livin組U2OS/DOX細(xì)胞中Livin表達(dá)水平顯著升高,t-Livin表達(dá)水平顯著降低,E-cadherin表達(dá)水平顯著降低,MMP-2表達(dá)水平顯著升高,細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)顯著升高(P<0.05,圖6,表5)。
Fig. 6 Expressions of related proteins and detection of migration and invasion cells
Tab. 4 Overexpression of Livin can reverse the inhibitory effect of ropivacaine hydrochloride on cell U2OS / DOX proliferation and promote apoptosis
Tab. 5 Overexpression of Livin can reverse the inhibitory effects of ropivacaine hydrochloride on cell U2OS / DOX migration and invasion
骨肉瘤是常見的骨原發(fā)惡性腫瘤,隨著化療等治療方式的進(jìn)步,明顯改善了骨肉瘤患者預(yù)后,但化療耐藥是如今骨肉瘤化療治療的一大問題,逆轉(zhuǎn)其化療耐藥性是提高其療效的關(guān)鍵[11]。以往研究發(fā)現(xiàn),麻醉藥物可影響腫瘤患者免疫功能及腫瘤患者術(shù)后轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)[12]。據(jù)報道,羅哌卡因可抑制人甲狀腺癌細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)其凋亡,且呈劑量依賴性[13]。高濃度的羅哌卡因?qū)Y(jié)腸癌和胰腺癌細(xì)胞具有體外抗增殖作用[14]。羅哌卡因可顯著降低結(jié)腸癌細(xì)胞SW480和SW620的活力[15]。他莫昔芬通過增加人骨肉瘤細(xì)胞MG-63對化療藥物多柔比星的敏感性而抑制細(xì)胞增殖[16]。本實驗建立骨肉瘤耐藥細(xì)胞U2OS/DOX后用不同濃度的鹽酸羅哌卡因處理,細(xì)胞增殖抑制率及凋亡率顯著升高,克隆形成數(shù)及遷移、侵襲數(shù)顯著減少; P21、Cleaved Caspase-3、E-cadherin的表達(dá)水平顯著升高, MMP-2表達(dá)水平顯著下降,呈濃度依賴性。P21是細(xì)胞周期相關(guān)蛋白,其高表達(dá)可阻滯細(xì)胞周期,抑制細(xì)胞增殖;而Cleaved Caspase-3是凋亡相關(guān)蛋白,其高表達(dá)表明細(xì)胞凋亡增多;E-cadherin是細(xì)胞間質(zhì)相關(guān)蛋白,MMP-2是基質(zhì)金屬蛋白酶,其均影響細(xì)胞遷移侵襲;因此,本實驗結(jié)果說明,鹽酸羅哌卡因可劑量依賴性的抑制U2OS/DOX細(xì)胞增殖、遷移、侵襲,并促進(jìn)細(xì)胞凋亡,其可能與調(diào)控相關(guān)蛋白表達(dá)有關(guān);即鹽酸羅哌卡因增加了骨肉瘤細(xì)胞對多柔比星的敏感性;與在其他腫瘤中相似,也具有抗癌作用。
Livin在骨肉瘤中高表達(dá),與骨肉瘤的Enncking分期與腫瘤大小顯著相關(guān),是骨肉瘤患者的獨立預(yù)后因素[17]。敲除Livin可以顯著降低U2OS細(xì)胞的細(xì)胞增殖,集落形成及侵襲和遷移能力,并增強(qiáng)人骨肉瘤細(xì)胞對順鉑的化學(xué)敏感性[18]。沉默Livin通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和自噬,提高了結(jié)腸癌細(xì)胞對5-氟尿嘧啶的敏感性[19]。敲低Livin誘導(dǎo)頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡,并增強(qiáng)了順鉑,5-氟尿嘧啶和多西他賽化療誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[20]。以上研究表明,Livin參與調(diào)控包括骨肉瘤在內(nèi)的多種腫瘤的進(jìn)展及藥物敏感性。Livin是細(xì)胞凋亡抑制劑蛋白家族的成員,該家族抑制多種刺激觸發(fā)的細(xì)胞凋亡;半胱天冬酶可以裂解Livin產(chǎn)生截短的蛋白t-Livin;當(dāng)Livin水平降低時,t-Livin水平便相對升高[21]。本實驗結(jié)果顯示,鹽酸羅哌卡因處理的U2OS/DOX細(xì)胞中Livin表達(dá)水平顯著降低,t-Livin表達(dá)水平升高。提示鹽酸羅哌卡因抗體可調(diào)控U2OS/DOX細(xì)胞中Livin的表達(dá)。此外,本實驗還發(fā)現(xiàn),過表達(dá)Livin逆了轉(zhuǎn)鹽酸羅哌卡因?qū)?xì)胞U2OS/DOX惡性生物學(xué)行為的影響。提示,鹽酸羅哌卡因可能通過調(diào)控Livin表達(dá)影響U2OS/DOX細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡。
綜上所述,鹽酸羅哌卡因能明顯抑制對多柔比星具有耐藥性的骨肉瘤細(xì)胞的增殖,遷移和侵襲,明顯促進(jìn)骨瘤細(xì)胞凋亡,其機(jī)制可能與Livin有關(guān)。