莪術(shù)醇對(duì)非酒精性脂肪性肝大鼠肝功能和肝纖維化的影響及機(jī)制*

齊書(shū)妍， 黃 華， 李永坤， 裴林國(guó)， 張文娟

(1. 南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部， 河南 南陽(yáng) 473000， 2. 南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校第一附屬醫(yī)院普外科， 河南 南陽(yáng) 473000)

非酒精性脂肪性肝病[1](nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)已成為全球常見(jiàn)的慢性肝病之一。Tateishi等[2]研究表明：NAFLD主要包括：?jiǎn)渭冃灾靖巍⒎蔷凭灾拘愿窝?nonalcoholic steatohepatitis，NASH)及其相關(guān)肝硬化和肝細(xì)胞癌。據(jù)報(bào)道，NASH 是繼慢性病毒性肝炎和酒精性肝炎后，肝纖維化的又一大成因。數(shù)據(jù)顯示： NASH 患者會(huì)在3至4 年內(nèi)發(fā)生肝纖維化(liver fibrosis，LF)[3]。LF是各類(lèi)肝損傷后的創(chuàng)傷愈合反應(yīng)，表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)生成和降解失衡，會(huì)導(dǎo)致大量細(xì)胞外基質(zhì)沉積于肝細(xì)胞[4]。蔣華波等[5]研究表明：肝纖維化可以進(jìn)展為肝硬化甚至肝癌，是導(dǎo)致肝臟慢性疾病走向死亡的重要因素。莪術(shù)醇(Curcumenol，CC)為郁金的主要活性成分之一，在多種郁金存在中，以桂郁金的莪術(shù)醇含量相對(duì)較高[6]。CC防治非酒精性脂肪性肝病機(jī)制在于抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)的表達(dá)，進(jìn)而使細(xì)胞外基質(zhì)合成受阻。此外，CC還能通過(guò)調(diào)節(jié)信號(hào)傳導(dǎo)通路發(fā)揮抗纖維化作用。季建平等[7]研究表明：莪術(shù)醇能降低肝指數(shù)、血清肝功能 ALT 與 AST 活性等緩解肝功能障礙。

本文旨在研究腎莪術(shù)醇對(duì)非酒精性脂肪性肝大鼠模型肝功能和肝纖維化的影響，以期了解莪術(shù)醇對(duì)非酒精性脂肪性肝大鼠模型肝功能和肝纖維化的干預(yù)作用及其機(jī)制，旨在為臨床采用CC防治非酒精性脂肪性肝和肝纖維化提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量為(200±20) g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(京)2017-0022。

1.2 藥物與試劑

CC(純度>98%)購(gòu)于上海同田生物技術(shù)股份有限公司；復(fù)方鱉甲軟肝片(compound biejiaruangan troche，CBT)購(gòu)自?xún)?nèi)蒙古福瑞醫(yī)療科技股份有限公司；白介素(interleukin，IL-6、IL-10、IL-1β)試劑盒子購(gòu)自武漢華聯(lián)科有限公司；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)試劑盒子購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、基質(zhì)金屬蛋白酶-1(matrix metalloproteinase-1，MMP-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1(TIMP-1)蛋白表達(dá)及Toll樣受體-4(toll-like receptor 4，TLR4)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子激活激酶-1(transforming growth factor activates kinase-1，TAK1)、血管細(xì)胞粘附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)試劑盒子購(gòu)自Thermo Fisher公司；核因子κB p65(nuclear factor κB p65，NF-κB p65)試劑盒子購(gòu)自上海滬尚生物科技有限公司。

1.3 儀器

電子記重秤(昆山巨天儀器設(shè)備有限公司)；低溫離心機(jī)(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司)；光學(xué)顯微鏡(北京世紀(jì)科信科學(xué)儀器有限公司)；熒光分光光度計(jì)(天津市津維電子儀表有限公司)；全自動(dòng)生化分析儀(日本 Olympus公司)；酶標(biāo)儀(濟(jì)南歐萊博科學(xué)儀器有限公司)；凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD 公司)。

1.4 模型建立

雄性SD大鼠以高脂飼料喂養(yǎng)12周，其中高脂飼料組成：脂肪含量44.0%；蛋白質(zhì)含量16.0% ；碳水化合物含量40.0%。根據(jù)Xu等[8]研究結(jié)果判斷造模是否成功。

1.5 分組及藥物干預(yù)

SD大鼠隨機(jī)分為6組，10只/組：空白對(duì)照組(Heathy control，Heathy ctrl)：普通飲食、模型組(NASH)：高脂飲食+腹腔注射生理鹽水(0.1 ml/10 g)、NASH+CBT組：高脂飲食+ 腹腔注射CBT(500 mg/kg)、高脂飲食+腹腔注射CC組(25、50、100 mg/kg)，莪術(shù)醇給藥每次3 d，共給藥7次。所有大鼠都隨意進(jìn)食和自來(lái)水。

1.6 大鼠肝臟占體重的百分比及血清HDL、TG、ALT、AST水平檢測(cè)

準(zhǔn)確稱(chēng)量大鼠肝臟質(zhì)量，使用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)大鼠體內(nèi)高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)、甘油三酯(triglycerides，TG)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)水平。

1.7 HE染色觀察肝纖維化情況

收集各組大鼠肝臟組織，常規(guī)石蠟包埋，制成厚度約為4 μm的組織切片，進(jìn)行HE染色，在電子顯微鏡下使用10×40的倍鏡觀察肝組織情況。

1.8 免疫組化檢測(cè)α-SMA、P65的陽(yáng)性染色情況

使用免疫組化染色大鼠組織，并觀察SMA表達(dá)情況及P65陽(yáng)性染色情況。

1.9 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)血清IL-6、IL-10、TNF-A、IL-1β細(xì)胞因子的表達(dá)

干預(yù)后，各組大鼠腹主動(dòng)脈采血，離心后分離血清，采用ELISA試劑盒檢測(cè)血清IL-6、IL-10、TNF-α、IL-1β水平，操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.10蛋白印跡(Westernblot)檢測(cè)蛋白表達(dá)水平

參照Western blot 檢測(cè)方法，采用掃描儀進(jìn)行掃描，以β-actin為內(nèi)參，應(yīng)用Imagaquent 5.1軟件對(duì)α-SMA、MMP-1、TIMP-1、TLR4、TAK1、NF-κB p65、及VCAM-1蛋白質(zhì)條帶灰度進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，繪圖采用GraphPda Prism5軟件。單因素方差分析時(shí)，當(dāng)組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，采用SNK方法進(jìn)行比較；使用單因素方差分析(ANOVA)時(shí)，所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 莪術(shù)醇對(duì)NASH大鼠肝臟占體重的百分比及血清生化指標(biāo)的影響

相比空白對(duì)照組，模型組大鼠肝臟占體重的百分比、AST、ALT、TG顯著升高，HDL含量顯著降低(P<0.05)；相比模型組，模型+CBT組、模型+莪術(shù)醇處理組肝臟占體重的百分比、AST、ALT、TG含量顯著降低，HDL含量顯著升高(P<0.05)；其中模型+CC組以高濃度組改善最顯著(P<0.05)，但各劑量改善幅度均低于模型+CBT組(P<0.05，表1)。

Tab. 1 Effects of CC on the ratio of liver to body weight and serum biochemical indexes in NASH rats n=10)

2.2 莪術(shù)醇對(duì)NASH大鼠肝纖維化的影響

空白對(duì)照組大鼠可見(jiàn)完整肝細(xì)胞及細(xì)胞核，細(xì)胞核與細(xì)胞漿分界明顯，易于區(qū)分；而模型組大鼠肝組織存在較多壞死細(xì)胞，且細(xì)胞出現(xiàn)纖維化，細(xì)胞間質(zhì)間存在空隙；模型鼠+CBT組大鼠肝細(xì)胞無(wú)顯著纖維化，且細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)呈鮮明對(duì)比；模型+莪術(shù)醇組處理大鼠，隨著莪術(shù)醇組濃度的升高，細(xì)胞核壞死和細(xì)胞纖維化程度明顯減輕(圖1)。

Fig. 1 Observation of liver fibrosis by HE staining (×400)

2.3 莪術(shù)醇對(duì)NASH大鼠細(xì)胞凋亡的影響

空白對(duì)照組、模型組、模型+CBT組及模型+莪術(shù)醇處理組細(xì)胞凋亡率分別為(8.23±2.15)%、(88.65±9.48)%、(5.32±1.16)%、(73.61± 9.86)%、(43.26±6.95)%、(18.24±8.47)%。與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；相比模型組，模型+CBT組和模型+莪術(shù)醇處理組細(xì)胞凋亡數(shù)目顯著降低(P<0.05)，其中模型+CC組以高濃度組改善最顯著(P<0.05)，但各劑量改善幅度均低于模型+CBT組(P<0.05，圖2)。

Fig. 2 Observation of apoptosis by TUNEL staining (×400)

2.4 莪術(shù)醇對(duì)NASH大鼠相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

相比空白對(duì)照組，模型組大鼠α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞占比、α-SMA、TIMP-1蛋白表達(dá)顯著升高，MMP-1蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)；相比模型組，模型+CBT組和模型+莪術(shù)醇處理組α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞占比、α-SMA、TIMP-1蛋白表達(dá)降低，MMP-1蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，其中模型+CC組以高濃度組改善最顯著(P<0.05)，但各劑量改善幅度均低于模型+CBT組(P<0.05，圖3，表2)。

Fig. 3 Expressions of related proteins detected by immunohistochemistry and Western blot

2.5 莪術(shù)醇對(duì)NASH大鼠相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的影響

相比空白對(duì)照組，模型組大鼠IL-6、TNF-α、 IL-1β含量升高，IL-10含量顯著降低(P<0.05)；相比模型組，模型+CBT組和模型+莪術(shù)醇處理組IL-6、TNF-α、 IL-1β含量顯著降低，IL-10含量顯著升高(P<0.05)，其中模型+CC組以高濃度組改善最顯著(P<0.05)，但各劑量改善幅度均低于模型+CBT組(P<0.05，表3)。

2.6 莪術(shù)醇對(duì)NASH大鼠相關(guān)信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響

相比空白對(duì)照組，模型組大鼠TLR4、TAK1、NF-κB p65、VCAM-1表達(dá)及P65陽(yáng)性細(xì)胞占比升高(P<0.05)；相比模型組，模型+CBT組和模型+莪術(shù)醇處理組TLR4、TAK1、NF-κB p65、VCAM-1表達(dá)及P65陽(yáng)性細(xì)胞占比顯著降低(P<0.05)，其中模型+CC組以高濃度組改善最顯著(P<0.05)，但各劑量改善幅度均低于模型+CBT組(P<0.05，圖4，表4)。

Fig. 4 Expressions of related signaling pathway proteins detected by immunohistochemistry and Western blot

Tab. 2 Effects of CC on the expressions of related proteins in NASH rats n=5)

Tab. 3 Effects of CC on the expressions of related cytokines in NASH rats (ng/ml, n=10)

Tab. 4 Effects of CC on the expressions of related signal pathway proteins in NASH rats n=5)

3 討論

席雨鑫等[9]研究表明：肝纖維化形成的機(jī)制可能與降解細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)合成與降解失調(diào)、ECM過(guò)度沉積相關(guān)。其中IL-1β參與調(diào)控ECM的合成和降解，同時(shí)TNF-α和IL-6也參與了肝纖維化形成。張海濤等[10]研究表明：血清TNF-α和IL-6水平隨纖維化程度的加重而不斷升高，TNF-α和IL-6不僅能通過(guò)激活機(jī)體炎癥反應(yīng)而介導(dǎo)纖維化過(guò)程，還能促進(jìn)ECM合成，進(jìn)而參與纖維化的形成。張倩璐等[11]研究證明：肝臟星狀細(xì)胞(HSC)的激活是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)，激活過(guò)程中形成的TGF-β1可明顯促進(jìn)纖維化進(jìn)程。肝纖維化過(guò)程中TIMP-1與MMP-1動(dòng)態(tài)平衡破壞，TIMP-1升高M(jìn)MP-1降低導(dǎo)致膠原纖維的累積并促進(jìn)肝纖維化的發(fā)展。從實(shí)驗(yàn)中可以看出，使用莪術(shù)醇處理后大鼠的TIMP-1、TNF-α、IL-6、TGF-β1顯著降低，抗炎癥因子IL-10、MMP-1顯著降低，說(shuō)明了大鼠的肝細(xì)胞外基質(zhì)降解減少、炎癥減輕，且肝纖維化程度受到了顯著的改善。隨著莪術(shù)醇濃度的增加，肝細(xì)胞凋亡、纖維化進(jìn)一步受到了抑制，說(shuō)明在一定濃度范圍內(nèi)呈濃度依賴(lài)性。

王健等[12]研究表明：脂類(lèi)代謝與肝臟功能密切相關(guān)，肝臟受損時(shí)，會(huì)使得肝細(xì)胞對(duì)TG抑制減小，使得TG含量顯著增加，同時(shí)劉鑫等[13]研究表明：血清ALT、AST水平與肝細(xì)胞損傷程度正相關(guān)。在本研究中，模型組大鼠血清TG、ALT、AST含量顯著高于對(duì)照組，證實(shí)模型組大鼠肝損傷程度嚴(yán)重，使用莪術(shù)醇處理后大鼠血清內(nèi)的TG、ALT、AST含量顯著降低，說(shuō)明莪術(shù)醇可以顯著降低肝臟的受損程度，且隨著莪術(shù)醇的濃度增加，肝臟受損程度負(fù)相關(guān)，表明在一定濃度范圍內(nèi)，莪術(shù)醇對(duì)非酒精性脂肪性肝的干預(yù)作用呈濃度依賴(lài)性。

TLR4是TLR家族中介導(dǎo)外源性配體LPS應(yīng)答的最主要受體[14]，慢性酒精攝入導(dǎo)致大鼠LPS水平明顯升高，TLR4信號(hào)通路被激活，致炎因子合成增加，活化型HSCs數(shù)量也隨之增加[15-17]。使得肝組織中 TLR4及 NF-κB p65 也隨之增高，使用莪術(shù)醇處理后，肝組織中 TLR4 及NF-κB p65 也隨之下降，表明莪術(shù)醇可抑制肝組織中TLR4 的表達(dá)，達(dá)到緩解肝損傷的作用。 研究表明：炎性細(xì)胞因子受刺激后，大量分泌會(huì)導(dǎo)致大鼠體內(nèi) NF-κB 信號(hào)通路的異常活化，而活化后的NF-κB信號(hào)通路又可以上調(diào)促炎癥因子IL-1、TNF-α的表達(dá)，降低抗炎癥因子 IL-10 的表達(dá)，兩者呈正反饋，加重肝臟炎癥反應(yīng)，加重肝臟的損傷。

綜上所述，莪術(shù)醇對(duì)非酒精性脂肪性肝大鼠模型肝功能和肝纖維化有顯著的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)TLR4、TAK1、NF-κB/p65信號(hào)通路降低炎癥因子升高抗炎癥因子有關(guān)。莪術(shù)醇改善HDL、TG、ALT、AST水平，降低相對(duì)肝質(zhì)量比重。雖然各劑量莪術(shù)醇的作用效果均不如陽(yáng)性對(duì)照藥物復(fù)方鱉甲軟肝片，但莪術(shù)醇的低毒性在臨床應(yīng)用中將有明顯的優(yōu)勢(shì)。