左旋卡尼汀對脂多糖誘導(dǎo)小鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬和凋亡的影響*

薛 峰， 王 輝， 許思多， 劉首挺， 龔永生， 范小芳

(溫州醫(yī)科大學(xué)低氧醫(yī)學(xué)研究所， 浙江 溫州 325035)

肺血管內(nèi)皮細(xì)胞(pulmonary microvascular endothelial cells，PMVECs)覆蓋于肺微血管表面，確保了肺泡和肺血管之間有效而快速的氣體交換，并能夠產(chǎn)生和分泌介質(zhì)，表達(dá)細(xì)胞表面受體和細(xì)胞粘附分子，并影響血管舒縮張力、炎癥反應(yīng)以及凝血功能。而肺血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷與通透性增加是急性肺損傷(acute lung injury, ALI)和急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)的主要發(fā)病機(jī)制之一，氧化應(yīng)激、自噬、凋亡與ALI/ARDS的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。左旋卡尼汀(L-carnitine，LC)，是由賴氨酸和甲硫氨酸生物合成的季胺化合物，在活細(xì)胞中，當(dāng)脂肪供能時,LC可用來將脂肪酸由胞漿轉(zhuǎn)運到線粒體中，具有能調(diào)節(jié)能量代謝和降低氧化損傷和改善線粒體功能[1]。同時LC還具有刺激肝臟生酮、促進(jìn)蛋白質(zhì)降解、刺激糖原異生等作用[2,3]。自噬是維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的一種重要途徑，可吞噬、包裹、降解自身細(xì)胞質(zhì)蛋白或細(xì)胞器，為細(xì)胞的正常生存、代謝提供原料[4]。LC是一種有效的組蛋白去乙?；敢种苿?histone deacetylase inhibitor，HDACIs)[5]，通過抑制HDAC1、HDAC3、HDAC8等發(fā)揮抗腫瘤的作用[6]。HDACIs的作用與調(diào)節(jié)自噬有著密切的關(guān)系[7，8]。前期預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)LC可增加LPS誘導(dǎo)血管的內(nèi)皮細(xì)胞存活率。然而，LC是否具有減輕ALI時PMVECs損傷的作用與機(jī)制，目前尚不清楚。本研究采用不同濃度LC作用于LPS誘導(dǎo)的小鼠PMVECs損傷，觀察LC對細(xì)胞存活、細(xì)胞自噬及凋亡的影響，為LC改善ALI/ARDS時PMVECs的損傷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗細(xì)胞

原代小鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(PMVECs)購自Cell Biologics公司。

1.2 主要試劑

內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基購自Sciencell公司；脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)購自Sigma公司；左旋卡尼汀(L-carnitine，LC)、CCK-8試劑盒購自Dojindo公司；兔抗多克隆LC3 A/B抗體、caspase-3抗體購自Abcam公司；抗兔熒光二抗購自Invitrogen公司；Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自BD公司。

1.3 實驗分組

復(fù)蘇PMVECs細(xì)胞，用0.25%胰酶消化細(xì)胞并傳代，取第4～5代細(xì)胞貼壁并達(dá)到(70～80)%融合后，換含0.1%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基使細(xì)胞同步生長24 h。為研究LPS干預(yù)對PMVECs細(xì)胞功能的影響，實驗分為2組，即：(1)對照(Control)組：用DMEM(含1%FBS)培養(yǎng)，取對應(yīng)時間點；(2)LPS組：10 μg/ ml LPS刺激小鼠PMVECs 3 h、6 h、12 h、24 h。為研究LC干預(yù)對LPS誘導(dǎo)的PMVECs細(xì)胞功能的影響，實驗分為3組，即：(1)對照(Control)組：用DMEM(含1%FBS)培養(yǎng)，取對應(yīng)時間點；(2)LPS組：10 μg/ml LPS刺激小鼠PMVECs 24 h。(3)LPS+LC組：10 μg/ml LPS處理的同時分別加入終濃度為2.5、5、10 mg/ml的LC，培養(yǎng)24 h。每組設(shè)6個復(fù)孔。根據(jù)LPS干預(yù)對PMVECs細(xì)胞活力以及凋亡時程的實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LPS干預(yù) 24 h組細(xì)胞活力最低、凋亡率最高。因此，在不同濃度的LC對LPS誘導(dǎo)的PMVECs實驗中選擇LPS干預(yù)24 h作為時間點。

1.4 細(xì)胞免疫熒光染色法檢測自噬小體

將第4代PMVECs按5×104cells/ml接種于預(yù)先放置多聚賴氨酸處理的玻片的6孔板中，待細(xì)胞生長良好后給予不同處理，同時設(shè)立陰性對照和空白對照。按規(guī)定培養(yǎng)不同時間后，棄去培養(yǎng)基，預(yù)冷的PBS清洗3次，4%多聚甲醛快速固定細(xì)胞15 min，預(yù)冷PBS洗滌3次，每次3 min；0.5%Triton X-100室溫5 min；PBS洗滌3次，每次3 min；滴加5% BSA室溫封閉1 h；加入LC3(1∶500)一抗并放入濕盒，4℃孵育過夜；次日，恢復(fù)至室溫后PBS洗3次，然后加抗兔熒光二抗(1∶10 000)室溫孵育1 h；PBS洗滌3次，每次3 min；再滴加DAPI避光孵育5 min，PBS洗滌3次，每次3 min；90%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.5 Western blot法檢測自噬蛋白、凋亡蛋白變化

提取各組細(xì)胞總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行定量，行SDS-PAGE凝膠電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜；5%脫脂奶粉封閉2 h，用PBST洗膜3次，每次10 min。分別加入含LC3(1∶500)或Caspase-3抗體(1∶1 000)的一抗，4℃孵育過夜；加入脫脂奶粉稀釋的二抗(1∶10 000)，室溫孵育1 h，PBST洗膜3次，每次10 min。用化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)顯影，凝膠成像系統(tǒng)采集圖片，并分析多條帶的灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白的條帶灰度值的比值表示蛋白相對表達(dá)水平。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率

各組PMVECs加入500 μl不含EDTA的胰酶消化5 min，1 000 g/min離心5 min，去除上清液，加入預(yù)冷PBS重懸細(xì)胞，1 000 g/min離心5 min，重復(fù)2次。用緩沖液重懸細(xì)胞(調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106cells/ml)，取100 μl細(xì)胞懸液加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，室溫孵育(避光)15 min，立即用流式細(xì)胞儀檢測。同時以不加Annexin V-FITC及PI的細(xì)胞作為陰性對照。Annexin V-FITC(FL1通道)+PI(FL2通道)雙染細(xì)胞，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm，F(xiàn)ITC陽性+PI陰性細(xì)胞所占象限百分比即為早期凋亡細(xì)胞占全部檢測細(xì)胞的百分比。

1.7 CCK-8檢測細(xì)胞活力

實驗分組同上，同時加設(shè)空白組(只有培養(yǎng)基而沒有細(xì)胞)。取第4代PMVECs細(xì)胞混懸液(1×105cells/ml)100 μl接種于96孔板中，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24 h后，分別加入LPS或不同濃度的LC，按規(guī)定培養(yǎng)不同時間后，棄去培養(yǎng)基，PBS洗2次，向各孔中加入100 μl 含10%CCK-8檢測試劑的無血清培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中孵育4 h，用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的各孔的OD值。細(xì)胞存活率=(處理組的OD值-空白組OD值)/(對照組的OD值-空白組OD值)%

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 LPS干預(yù)對PMVECs細(xì)胞活力時程的影響

與 Control組比較，LPS 6 h、12 h、24 h組PMVECs細(xì)胞活力顯著受到抑制，24 h組細(xì)胞活力最低，隨著時間的延長，細(xì)胞活性逐漸降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.01，表1)。

2.2 LPS干預(yù)對PMVECs凋亡時程的影響

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS 3 h組與Control 3 h組凋亡率無差異(2.87±0.71vs1.83±0.37,P>0.05);LPS 6h較Control 6 h組凋亡率明顯增高 (4.88±0.43vs2.55±0.60，P<0.01) LPS 12 h組較Control 12 h凋亡率明顯增高(5.22±0.74vs2.85±0.47，P<0.01);LPS 24 h組較Control 24 h組凋亡率也顯著增高(10.68±1.18vs3.47±0.56，P< 0.01)，以LPS 24 h組凋亡率最高(圖1)。

Fig. 1 Apoptosis of PMVECs induced by LPS at different time points detected by flow cytometry with Annexin V-FITC/PI n=3)

2.3 LPS誘導(dǎo)PMVECs自噬蛋白 LC3Ⅱ表達(dá)時程的影響

細(xì)胞免疫熒光標(biāo)記技術(shù)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Control組LC3Ⅱ蛋白綠色熒光斑點微弱(± --+)，LPS干預(yù)3 h、6 h、12 h和24 h組綠色熒光斑點閃亮(++ --+++)(圖2A)。Western blot 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS 3 h組、LPS 6 h組、LPS 12 h組、LPS 24 h組較Control組LC3Ⅱ蛋白表達(dá)明顯增加，具有統(tǒng)計學(xué)意義(1.34±0.04、1.52±0.03、1.52±0.03、1.51±0.04vs1.00±0.00，P<0.01)，6 h后達(dá)到高峰，6 h、12 h與24 h三組間無統(tǒng)計學(xué)差異(圖2B)。

Fig. 2 The dynamic changes of autophagy activation of PMVECs induced by LPS determined by immunofluorescence (×400) and Western n=6)

2.4 不同濃度的LC對LPS誘導(dǎo)的PMVECs細(xì)胞活力的影響

CCK-8檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS組較Control組細(xì)胞活力顯著下降(43.17±3.44vs100±1.15，P<0.01)；LC2.5組、LC5組、LC10組較LPS組細(xì)胞活力顯著增高(65.33±4.99、82.50±5.38、 92.44±5.97vs43.17±3.44，P<0.01)，具有統(tǒng)計學(xué)意義(圖 3)

Fig. 3 The effects of LC at different concentrations on PMVECs viability for 24 h were measured by CCK-8 assay n=6)

2.5 不同濃度的LC對LPS誘導(dǎo)的PMVECs自噬蛋白LC3Ⅱ的影響

細(xì)胞免疫熒光標(biāo)記檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與LPS 24 h組比較，不同濃度的LC(2.5、5、10 μg/ ml)處理24 h后進(jìn)一步增加了熒光顆粒的表達(dá)(+++ --++++)(圖4A)。Western blot 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS組較Control組LC3Ⅱ蛋白表達(dá)顯著增高(1.40±0.06vs1.00± 0.00，P<0.01)；LPS組與LC2.5組LC3Ⅱ蛋白表達(dá)無顯著差異(1.40±0.06vs1.56±0.05，P>0.05)；LC5組、LC10組較LPS組LC3Ⅱ蛋白表達(dá)顯著增高 (1.65±0.05、1.63±0.07vs1.40±0.06，P<0.05，圖4B)。

Tab. 1 The effects of LPS on PMVECs viability were measured by CCK-8 n=6)

Fig. 4 The changes of autophagy activation of PMVECs induced by LC at different concentrations determined by immunofluorescence (×400) and Western n=6)

2.6 不同濃度的LC對LPS誘導(dǎo)的PMVECs細(xì)胞凋亡率以及凋亡蛋白的影響

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS組較Control組凋亡率明顯增高(10.33±0.72vs1.50±0.57，P< 0.01)；LC2.5組、LC5組、LC10組較LPS組凋亡率明顯降低(7.47±0.72、4.63±0.70、3.83±0.39vs10.33±0.72，P<0.01，圖5A、5B)。Western blot 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS組較Control組凋亡蛋白Caspase-3表達(dá)明顯升高(2.66±0.19vs1.00±0.00 ，P<0.01)，LC2.5組與LPS組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(2.50±0.28vs2.66±0.19，P>0.05)；LC5組、LC10組較LPS組凋亡蛋白Caspase-3表達(dá)明顯降低(2.28±0.18、 1.76±0.24vs2.66±0.19，P<0.01，圖5C)。

3 討論

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)和(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是由心源性以外的各種致病因素導(dǎo)致的急性、進(jìn)行性加重的呼吸衰竭，多種病理生理過程參與其中，包括氧化應(yīng)激，炎癥反應(yīng)、自噬、凋亡等。ARDS的共同機(jī)制是失控的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的肺上皮細(xì)胞和肺泡血管內(nèi)皮細(xì)胞的廣泛損傷，微血管內(nèi)皮細(xì)胞是正常微血管功能核心，具有調(diào)節(jié)血管張力，保持緊密的滲透屏障，防止中性粒細(xì)胞黏附、血細(xì)胞滲出及降低微血管血栓形成的能力，因此微血管內(nèi)皮細(xì)胞對維持微血管和器官功能起重要作用[9]。炎癥反應(yīng)參與了ALI/ARDS的發(fā)病機(jī)制，中性粒細(xì)胞大量的聚集釋放多種炎癥因子可加重ALI，其機(jī)制包括中性粒細(xì)胞被激活釋放ROS[10]，多核白細(xì)胞的彈性蛋白酶、基質(zhì)金屬蛋白酶、防御素的釋放等[11]。近期研究發(fā)現(xiàn)脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)影響肺泡巨噬細(xì)胞功能[12]，凋亡在其中發(fā)揮著重要作用，ARDS早期患者的支氣管肺泡灌洗液能在體外抑制多核白細(xì)胞凋亡，且在LPS引起的小鼠ALI模型中發(fā)現(xiàn)了廣泛的肺泡上皮凋亡[13]，而肺血管內(nèi)皮細(xì)胞也是ALI/ARDS發(fā)病的重要靶點。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS刺激小鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(pulmonary microvascular endothelial cells，PMVECs) 6 h、12 h、24 h后，各時間點細(xì)胞存活率顯著下降，時間愈長，其細(xì)胞活存率下降愈明顯，24 h時細(xì)胞存活率最低；同時發(fā)現(xiàn)，LPS刺激PMVECs后，各時間點的細(xì)胞凋亡率、自噬蛋白LC3表達(dá)顯著增高，表明PMVECs的凋亡與自噬參與了LPS引起的PMVECs的損傷。近年來研究表明，LPS可誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激，產(chǎn)生的ROS能影響自噬發(fā)生[14]，自噬在I/R誘發(fā)的肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中發(fā)揮保護(hù)性作用，提高自噬水平有助于減少I/R條件下細(xì)胞凋亡并維持內(nèi)皮屏障完整性[15]。在LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷模型中，增強(qiáng)自噬也可通過限制肺微血管屏障的損傷達(dá)到保護(hù)的作用[16]。

Fig. 5 Apoptosis of PMVECs in various groups detected by flow cytometry with Annexin V-FITC/PI staining(n=3) The protein expression of caspase-3 determined by Western n=6)

左旋卡尼汀是一個內(nèi)生輔助因子，可增強(qiáng)碳水化合物的新陳代謝，減少細(xì)胞內(nèi)積累的有毒代謝產(chǎn)物[17]。最近有文獻(xiàn)證明，左旋卡尼汀調(diào)節(jié)過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)誘導(dǎo)自噬并恢復(fù)高脂飲食誘導(dǎo)的線粒體功能障礙[18]。同時研究表明，自噬可能在小鼠局灶性I/R損傷中發(fā)揮保護(hù)作用[19]。而在我們實驗中發(fā)現(xiàn)LC可促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的PMVECs自噬，可能通過物質(zhì)和能量的循環(huán)再利用、降解受損的細(xì)胞器或清除細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、過氧化物體、線粒體的更新，參與細(xì)胞的分化與細(xì)胞的發(fā)育，參與細(xì)胞在亞細(xì)胞水平的重構(gòu)等對維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)不同濃度左旋卡尼汀作用于LPS誘導(dǎo)的PMVECs的損傷，細(xì)胞自噬表達(dá)增加、凋亡率減少，細(xì)胞的活力顯著提高；表明左旋卡尼汀可通過增強(qiáng)細(xì)胞自噬、減少凋亡而減輕了LPS對PMVECs功能的損傷。提示左旋卡尼汀可能具有減輕ALI/ARDS時肺微血管屏障的作用，其機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。