基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接探討紫草治療胃癌的作用機制

張飛，趙琦，劉杰民游紹偉黃敬

（1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州貴陽550025；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，貴州貴陽550003；3.貴州省人民醫(yī)院，貴州貴陽550002）

胃癌（gastric cancer）作為全球第五大最常見的癌癥，目前該病的治療方法取得了可觀的進(jìn)步，但是其仍然是我國以及全世界發(fā)病率和死亡率較高的惡性腫瘤之一[1,2]。由于胃癌的早期發(fā)病較隱匿，大多數(shù)患者診斷出已是中晚期，往往錯過了最佳的治療時機。胃癌的主要治療方法為手術(shù)治療和化學(xué)靶向療法，但是其導(dǎo)致的術(shù)后復(fù)發(fā)率高和易出現(xiàn)耐藥性對該病的治療增添了難度，因此急需尋找出能夠輔助治療胃癌且副作用低的藥物。有研究表明，中藥的有效成分可通過多途徑、多機制抑制腫瘤生長和逆轉(zhuǎn)由化療引起的耐藥現(xiàn)象，其具有療效確切、副作用少和整體調(diào)節(jié)等優(yōu)點，在治療惡性腫瘤方面具有積極的前景[3,4]。

紫草（Radix Arnebiae）為紫草科植物新疆紫草（Arnebia euchroma Johnst）或內(nèi)蒙紫草（Arnebia guttata Bunge）的干燥根，具有清熱涼血、活血解毒及透疹消斑等作用[5,6]。近年來多項研究發(fā)現(xiàn)紫草及其化學(xué)成分具有明顯的抗腫瘤作用[7,8]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)對生物系統(tǒng)的網(wǎng)絡(luò)分析，選取特定信號節(jié)點進(jìn)行多靶點藥物分子設(shè)計的新學(xué)科[9]。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對紫草的化學(xué)成分、靶點及通路進(jìn)行深入的研究和預(yù)測，發(fā)揮其天然藥物獨有的優(yōu)勢，為其治療胃癌提供可靠依據(jù)。

1 方法

1.1 紫草有效成分的收集

主要通過TCMSP（https://tcmspw.com/tcmsp.php）數(shù)據(jù)庫平臺（中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫），點擊選項“Herb name”將“紫草”作為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索。依據(jù)OB值（口服生物利用度）≥30%、DL值（藥物相似性）≥0.18及Swissadme數(shù)據(jù)庫（http://www.swissadme.ch）中的藥代動力學(xué)特性和藥性兩者均評價好的原則進(jìn)行有效成分的初篩。

1.2 紫草靶點的預(yù)測及構(gòu)建成分―靶點網(wǎng)絡(luò)

將篩選出來的有效成分通過PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫獲取與之相對應(yīng)的SMILES號，并上傳至SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶點預(yù)測，預(yù)測選項設(shè)置為Homo sapiens，將預(yù)測出的藥物靶點輸入Uniprot（https://www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫中轉(zhuǎn)化為標(biāo)準(zhǔn)的基因名，并通過繪圖軟件Cytoscape構(gòu)建出紫草的有效成分—靶點網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3 胃癌的靶點收集

通過GeneCards（人類基因數(shù)據(jù)庫）疾病數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）以“Gastric Cancer”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，取評分高的靶點作為胃癌的靶點。

1.4 紫草與胃癌的交集靶點

利用Bioinformatics網(wǎng)站（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）的自定義繪制維恩圖功能，對得到的紫草靶點和胃癌靶點進(jìn)行交集，得出兩者的交集靶點即紫草治療胃癌的潛在有效靶點。

1.5 PPI（蛋白間相互作用）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將上述得出的交集靶點導(dǎo)入STRING（蛋白間相互作用網(wǎng)絡(luò)功能富集分析）數(shù)據(jù)庫（https://stringdb.org/）進(jìn)行分析，將物種限定為Homo sapiens，根據(jù)所需設(shè)置靶點間的要求和得分導(dǎo)出結(jié)果，并用Cytoscape軟件對關(guān)鍵靶點進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析。

1.6 GO分析和KEGG通路分析及靶點―通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

Metascape（https://metascape.org/gp/index.html）作為生物學(xué)數(shù)據(jù)庫，結(jié)合了功能豐富、交互組分分析和基因注釋等功能[10]，通過該數(shù)據(jù)庫對有效靶點進(jìn)行GO分析和KEGG（基因組百科全書）通路分析，將P＜0.01作為篩選條件并導(dǎo)出結(jié)果，再利用Cytoseape軟件將KEGG分析得出的關(guān)鍵通路構(gòu)建“靶點—關(guān)鍵通路”的網(wǎng)絡(luò)。

1.7 分子對接驗證

首先在PDB數(shù)據(jù)庫中下載紫草關(guān)鍵靶點的蛋白3D圖，并在PubChem數(shù)據(jù)庫中下載有效成分的2D結(jié)構(gòu)，通過Chem3D軟件進(jìn)行優(yōu)化處理，并利用Py-MOL 2.4軟件對有效成分進(jìn)行除水、去除原配體，最后運用AutoDockVina軟件進(jìn)行分子對接并將結(jié)果可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 紫草的有效成分

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選出OB值≥30%、DL值≥0.18以及藥代動力學(xué)特性好的紫草有效成分共12種，由于1-甲氧乙酰紫草堿無對應(yīng)的靶點，最終得出活性以及藥效較好的有效成分有11種，見表1。

表1 紫草有效成分Table 1 The effective components of Radix arnebia

2.2 藥物靶點篩選及成分―靶點網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

對其上述11種有效成分在Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行靶點預(yù)測，篩選出對其評分較高的靶點，將其導(dǎo)入Uniprot數(shù)據(jù)庫對名稱進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，并進(jìn)行整理及去重得出紫草的靶點有110個，通過Excel表格將有效成分和預(yù)測靶點進(jìn)行整合，并通過Cytoscape軟件構(gòu)建出有效成分―靶點網(wǎng)絡(luò)圖，見圖1。

圖1 有效成分―靶點網(wǎng)絡(luò)Fig.1 The active component-target network

2.3 胃癌靶點的收集及獲取有效靶點

利用GeneCards數(shù)據(jù)庫收集到胃癌靶點有11 842個，篩選出排名較前、可信度高的靶點共3 000個，將疾病和藥物靶點上傳至Bioinformatics網(wǎng)站繪制維恩圖，見圖2。對得出的65個有效靶點進(jìn)行整理，見表2。

表2 紫草治療胃癌的有效靶點Table 2 The effective target of Radix arnebiae in the treatment of gastric cancer

圖2 藥物―癌癥靶點維恩圖Fig.2 The venn diagram of the drug cancer targets

2.4 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)

為全面探討紫草對胃癌的作用機制，將得出的65個有效靶點上傳至STRING數(shù)據(jù)庫獲得PPI網(wǎng)絡(luò)圖，其中PPI網(wǎng)絡(luò)中包含65個節(jié)點、284條邊及平均節(jié)點度8.74（圖3）。將其導(dǎo)入Cytoscape軟件中，根據(jù)節(jié)點大小篩選出排名靠前的11個關(guān)鍵靶點（圖4），由此可見AKT1、PTGS2和PTEN等為關(guān)鍵靶點。

圖3 紫草治療胃癌的靶點PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.3 The PPI network as the target ofin the treatment of gastric cancer

圖4 紫草治療胃癌的關(guān)鍵靶點Fig.4 The key target ofin the treatment of gastric cancer

2.5 GO富集分析和KEGG分析

GO富集分析包括細(xì)胞組分、分子功能和生物過程3個方面[11]。將紫草治療胃癌的65個有效靶點導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，設(shè)定物種為人及P＜0.01，結(jié)果顯示主要為細(xì)胞對激素刺激的反應(yīng)（cellular response to hormone stimulus）、脂質(zhì)生物合成過程（lipid biosynthetic process）和對酸性化學(xué)物質(zhì)的反應(yīng)（response to acid chemical）等9個生物過程（BP）；包括脂質(zhì)結(jié)合（lipid binding）、磷酸轉(zhuǎn)移酶活性（phosphotransferase activity）和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（transcription factor binding）等10個分子功能（MF）；膜筏（membrane raft）、受體復(fù)合物（receptor complex）和核膜（nuclear envelope）等10個細(xì)胞組成（CC）。具體分析結(jié)果，見圖5。

圖5 紫草治療胃癌的有效靶點GO富集分析Fig.5 The enrichment analysis of effective targets GO enrichment of Radix arnebiae in the treatment of gastric cancer

基于Metascape數(shù)據(jù)庫的KEGG富集分析顯示[12]，有效靶點主要涉及的通路為癌癥的途徑（pathways in cancer）、乳腺癌（breast cancer）、類固醇激素生物合成（steroid hormone biosynthesis）、花生四烯酸代謝（arachidonic acid metabolism）、PPAR信號通路（PPAR signaling pathway）、IL-17信號通路（IL-17 signaling pathway）、腫瘤中的microRNA（MicroRNAs in cancer）、NF-B信號通路（NF-kappa B signaling pathway）和癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)（Transcriptional misregulation in cancer）等通路，結(jié)果見圖6，其中縱軸為通路名稱，橫軸表示富集因素的百分比，氣泡顏色和大小分別代表P值和富集靶點數(shù)，顏色越綠代表P值越小。

圖6 紫草治療胃癌有效靶點的KEGG分析Fig.6 The KEGG analysis of effective targets forin the treatment of gastric cancer

2.6 分子對接分析

為證明紫草化合物和靶點蛋白間的結(jié)合活性，通過成分―靶點網(wǎng)絡(luò)和相關(guān)文獻(xiàn)[13,14]報道，將谷甾醇、乙酰紫草素、油酸乙酯（NF）和紫草素等共7種有效成分與PPI中度值排名靠前的關(guān)鍵靶點AKT1、PTGS2、PTEN和MTOR進(jìn)行對接，其結(jié)合能小于0提示配體與受體可自發(fā)結(jié)合，若結(jié)合能≤-20.9kJ/mol表明有較好結(jié)合活性，≤-29.26 kJ/mol表明有強的結(jié)合活性[15,16]。本次分子對接顯示其結(jié)合能均小于0，篩選出本次對接結(jié)合能≤-20.9 kJ/mol的結(jié)果，見表3。由表3可以得出乙酰紫草素、紫草素和AKT1的結(jié)合能最佳，見圖7。

圖7 乙酰紫草素、紫草素和AKT1對接圖Fig.7 The docking diagram of acetylshikonin,shikonin and AKT1

表3 紫草中化合物與靶點對接結(jié)合能Table 3 Docking and binding of compounds in Radix arnebiae with target

3 討論

中藥有著出色的抗癌作用，其抗腫瘤機制也是近年來的研究熱點。胃癌在中醫(yī)的病因病機為本虛標(biāo)實，即脾虛為本，氣滯、濕熱和血瘀為實[17,18]。紫草作為清熱藥，其功效不僅限于對熱證類病的治療，在抗腫瘤方面也具有非常重要的作用。近年來隨著中西醫(yī)結(jié)合的興起，越來越多的中藥在癌癥的治療中起到了重要的作用。

通過對紫草有效成分的收集和篩選，得出的有效成分主要包括乙酰紫草素（acetylshikonin）、油酸乙酯（Ethyl oleate）、谷甾醇（sitosterol）、紫草素（shikonin）、亞油酸乙酯（mandenol）和磷脂酰膽堿B（lithospermidin B）等11種化合物，這些具有良好藥效的成分是紫草治療胃癌的物質(zhì)基礎(chǔ)。在上述有效成分中乙酰紫草素、谷甾醇及紫草素的研究較為廣泛。張志琴等[19]收集了1977―2020年關(guān)于乙酰紫草素藥理學(xué)、藥代動力學(xué)的相關(guān)信息，證明乙酰紫草素具有抗癌、抗炎等作用。TOPK作為一種絲氨酸蛋白激酶，在胃癌中蛋白表達(dá)水平及活性升高，有研究證明乙酰紫草素可直接抑制TOPK活性，減少TOPK信號的磷酸化和激活，從而抑制腫瘤的生長[20,21]。孫玉成等[22]研究發(fā)現(xiàn)-谷甾醇能抑制胃癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，其機制可能與-谷甾醇通過PI3K/AKT/mTOR通路誘導(dǎo)細(xì)胞自噬作用相關(guān)。張哲宇等[23]在對左金丸治療胃癌的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中也發(fā)現(xiàn)其有效成分包含谷甾醇；另外紫草素在胃癌甚至其他腫瘤研究中也有較明顯的進(jìn)展。梁文全等[24]通過整理分析得出由于不同腫瘤細(xì)胞系對紫草素的敏感性不同，在1～20M范圍內(nèi)即可顯著抑制胃癌、肝癌和結(jié)直腸癌等消化系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞的生長。研究表明[25]紫草素可顯著抑制人胃癌細(xì)胞增殖，同時促其凋亡，其機制可能與上調(diào)人胃癌細(xì)胞PTEN蛋白表達(dá)有關(guān)。

對紫草和胃癌靶點的收集和篩選，得出紫草－胃癌有效靶點65個，將65個靶點進(jìn)行PPI分析，得出關(guān)鍵靶點AKT1、PTGS2、PTEN和MTOR等共11個。AKT1又稱為蛋白激酶B，其在胃癌組織中高表達(dá)，參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展，有研究證明AKT1基因沉默可促進(jìn)胃癌BGC-823細(xì)胞裸鼠移植瘤細(xì)胞凋亡，并增強阿霉素（廣譜抗癌化療藥物）對移植瘤組織細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用[26,27]。趙小蕾等[28]通過生物信息學(xué)分析得出PTGS2為胃癌的關(guān)鍵基因。PTEN基因?qū)τ谖赴┑囊饬x重大，研究得出胃腺癌組織PTEN表達(dá)降低，與胃癌組織低分化、伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期等生物學(xué)特性有關(guān)，預(yù)示胃癌不良預(yù)后[29]。PTEN也可能是胃癌的潛在治療靶點，下調(diào)PTEN表達(dá)可抑制胃癌的惡性生物學(xué)行為[30]。另有研究證實由MTOR組成的AKT/MTOR信號通路在胃癌細(xì)胞的生長、分化、增殖、代謝和細(xì)胞骨架重組等系列功能中發(fā)揮重要的作用，從而導(dǎo)致胃癌細(xì)胞凋亡或存活[31]。結(jié)合分子對接的結(jié)果說明紫草在胃癌的治療中主要是通過AKT1、PTGS2、PTEN和MTOR等靶點發(fā)揮作用。

GO分析顯示，紫草主要通過細(xì)胞對激素刺激的反應(yīng)、脂質(zhì)生物合成過程、脂質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、受體復(fù)合物等對胃癌產(chǎn)生作用。KEGG通路分析得出和紫草治療胃癌富集的通路主要在癌癥的途徑、乳腺癌、腫瘤中的microRNA、IL-17和NF-B等信號通路，表明紫草具有明顯的抗癌功效。研究表明，microRNA在胃癌患者中有明顯的異常性表達(dá)，并對于胃癌的診斷及預(yù)后能夠起重要作用[32]。李春波等[33]發(fā)現(xiàn)IL-17可能通過NF-B信號通路刺激IL-6參與胃癌的免疫調(diào)控以及促進(jìn)胃癌的發(fā)生發(fā)展。另還有研究證明PHF5A在胃癌腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)，可能為癌基因激活NF-B信號通路參與了胃癌細(xì)胞MGC803的增殖和遷移[34]。以上結(jié)果說明紫草是通過多種通路對胃癌產(chǎn)生治療作用，但具體的機制還需進(jìn)一步通過實驗去證實。

綜上所述，本研究表明紫草治療胃癌的主要成分有乙酰紫草素、谷甾醇、紫草素、亞油酸乙酯和磷脂酰膽堿B等，主要作用于AKT1、PTGS2、PTEN、MTOR和ESR1等關(guān)鍵靶點以及對腫瘤中的microRNA、IL-17信號通路和NF-B信號通路等通路的調(diào)節(jié)，發(fā)揮對胃癌的治療作用。本研究通過數(shù)據(jù)挖掘和分子對接對紫草治療胃癌進(jìn)行分析，為今后探索紫草治療胃癌的研究奠定了基礎(chǔ)。