程序性細(xì)胞死亡的分子機(jī)制及其與干性年齡相關(guān)性黃斑變性的關(guān)系△

利虹瑛 李 艷 張夢(mèng)圓 姚 勇 蔡季平 謝田華 邵 珺

年齡相關(guān)性黃斑變性 (AMD) 是一種視網(wǎng)膜黃斑區(qū)結(jié)構(gòu)的衰老性病變。Bruch 膜增厚、玻璃膜疣形成、視網(wǎng)膜色素上皮 (RPE) 細(xì)胞和感光細(xì)胞損傷、脈絡(luò)膜新生血管是AMD的主要病理特征[1]。AMD分為干性和濕性，目前臨床上對(duì)濕性AMD的治療已取得巨大進(jìn)展，如抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、光動(dòng)力療法等，但對(duì)于干性AMD仍無(wú)有效治療方法。RPE細(xì)胞死亡在干性AMD疾病發(fā)展中起著關(guān)鍵調(diào)控作用。程序性細(xì)胞死亡是一類由特定基因介導(dǎo)并調(diào)控的細(xì)胞死亡過(guò)程，在人體生長(zhǎng)發(fā)育、疾病調(diào)節(jié)中起著重要作用[2]。程序性細(xì)胞死亡主要有凋亡、自噬、壞死性凋亡、焦亡和鐵死亡5種形式。本文就近年來(lái)5種程序性細(xì)胞死亡在干性AMD中的研究進(jìn)展作一綜述，為干性AMD的發(fā)病機(jī)制研究及治療提供新思路。

1 AMD臨床現(xiàn)狀及發(fā)病機(jī)制

AMD是導(dǎo)致全球老年人失明的主要原因。據(jù)報(bào)道，2020年全球AMD的患者約達(dá)1.96億人，預(yù)計(jì)到2040年將增加到2.88億人[3]。除了衰老這一主要因素外，AMD的病因還包括遺傳、性別、種族、飲食、吸煙、慢性光損傷、體重指數(shù)、高血壓、脈絡(luò)膜血管功能不全等[4]。AMD的臨床癥狀主要表現(xiàn)為進(jìn)行性中心視力急劇下降，病情呈不可逆性進(jìn)展。根據(jù)有無(wú)脈絡(luò)膜新生血管，可分為干性和濕性兩大類。濕性AMD的臨床表現(xiàn)更為嚴(yán)重，但干性AMD發(fā)病率更高，且晚期干性AMD有可能進(jìn)一步發(fā)展為濕性。干性AMD患者RPE細(xì)胞受損后其吞噬功能下降，Bruch 膜增厚，玻璃膜疣形成，誘發(fā)炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步導(dǎo)致RPE細(xì)胞死亡及脈絡(luò)膜毛細(xì)血管萎縮[5]。程序性細(xì)胞死亡導(dǎo)致的RPE細(xì)胞死亡在干性AMD的發(fā)病機(jī)制中起到一定的作用，其背后的潛在機(jī)制仍未完全被人們了解。

2 程序性細(xì)胞死亡的分子機(jī)制

程序性細(xì)胞死亡廣泛參與多種疾病的病理生理過(guò)程，其分子機(jī)制經(jīng)常被用作疾病的治療靶點(diǎn)。除了經(jīng)典的凋亡和自噬外，新的程序性細(xì)胞死亡形式包括壞死性凋亡、焦亡和鐵死亡。表1主要從形態(tài)學(xué)特征、生化特征、有無(wú)炎癥反應(yīng)和核心靶點(diǎn)四個(gè)方面對(duì)5種程序性細(xì)胞死亡特征進(jìn)行了比較。

表1 5種程序性細(xì)胞死亡特征的比較

3 程序性細(xì)胞死亡與干性AMD的關(guān)系

3.1 細(xì)胞凋亡與干性AMD細(xì)胞凋亡是機(jī)體通過(guò)調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)激活或抑制細(xì)胞自主死亡的過(guò)程。凋亡的啟動(dòng)依賴于caspase家族的激活。在外來(lái)信號(hào)刺激下，起始 caspase (caspase-8、caspase-9) 激活，進(jìn)而激活執(zhí)行 caspase (caspase-3、caspase-6、caspase-7) ,引發(fā)下游連鎖反應(yīng)，誘發(fā)凋亡。細(xì)胞活力測(cè)定、免疫印跡凋亡關(guān)鍵蛋白評(píng)價(jià)、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記等是細(xì)胞凋亡的常用檢測(cè)方法[6]。

隨著年齡的增長(zhǎng)，線粒體功能障礙會(huì)誘導(dǎo)RPE細(xì)胞凋亡，加速干性AMD的發(fā)病。研究發(fā)現(xiàn)，AMD患者RPE細(xì)胞中凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增多且 caspase-3 表達(dá)上調(diào)[7]。Z-VAD-FMK (Pan caspase抑制劑)、Z-IETD-FMK(caspase-8抑制劑)或Z-ATAD-FMK(caspase-12抑制劑)等凋亡抑制劑能夠逆轉(zhuǎn)7-酮膽固醇(一種脂蛋白沉積氧化產(chǎn)物)誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞凋亡[8]。β-淀粉樣蛋白(玻璃膜疣的主要成分)通過(guò)激活糖基化終末產(chǎn)物受體/核因子κB(NF-κB)信號(hào)通路，激活 caspase-3，誘導(dǎo)RPE細(xì)胞凋亡[9]。蒺藜醇[10]、白皮杉醇[11]通過(guò)激活 PI3K/Akt-Nrf2 信號(hào)通路，以Nrf2作為轉(zhuǎn)錄因子，誘導(dǎo)抗氧化基因 (HO-1、NQO1、GCLC、SOD1) 表達(dá)，降低氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞凋亡。異染色質(zhì)通過(guò)抑制 P53 介導(dǎo)的RPE凋亡，緩解AMD病情[12]。Krüppel樣轉(zhuǎn)錄因子4通過(guò)激活白細(xì)胞介素-17受體A介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)RPE細(xì)胞凋亡[13]。miRNA是一類非編碼RNA，在許多疾病過(guò)程中起著不可或缺的作用。Liu 等[14]發(fā)現(xiàn)，miR-21-3p可負(fù)性調(diào)控G蛋白信號(hào)調(diào)節(jié)因子4誘導(dǎo)的 caspase-3 活性，促進(jìn)RPE細(xì)胞凋亡。miR-144 通過(guò)直接靶向作用于Nrf2，促進(jìn)Nrf2降解，抑制Nrf2介導(dǎo)的抗凋亡作用[15]；同樣，miR-626通過(guò)靶向kelch樣 ECH 關(guān)聯(lián)蛋白1，抑制其與Nrf2結(jié)合，促進(jìn)Nrf2入核，激活Nrf2介導(dǎo)的抗凋亡作用[16]。miR-374a 則通過(guò)靶向 FasL/Fas 通路抑制 caspase-3 激活[17]。由此可見，細(xì)胞凋亡與干性AMD關(guān)系密切，它在干性AMD的預(yù)防和治療中的作用有待進(jìn)一步研究。

3.2 細(xì)胞自噬與干性AMD細(xì)胞自噬是一種廣泛存在的溶酶體依賴的細(xì)胞內(nèi)降解過(guò)程，主要分為巨自噬、微自噬和伴侶介導(dǎo)的自噬。自噬的經(jīng)典過(guò)程可以概括為：(1)引發(fā)/成核；(2)延伸；(3)成熟；(4)融合和降解。多種蛋白參與了這一過(guò)程，包括自噬相關(guān)蛋白、自噬基因Beclin-1、p62蛋白、mTOR、微管相關(guān)蛋白輕鏈3[18]。

在干性AMD的發(fā)展中，視網(wǎng)膜組織不斷產(chǎn)生視黃醛、脂褐素、受損蛋白質(zhì)、玻璃膜疣等毒性細(xì)胞代謝物，自噬能有效地清除RPE細(xì)胞中的細(xì)胞代謝物，緩解AMD的進(jìn)展[19]。RPE細(xì)胞自噬功能障礙在AMD的發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，AMD患者RPE細(xì)胞的自噬流水平顯著降低[20]。自噬核心基因 ATG5 和 ATG7 敲除小鼠可呈現(xiàn)AMD樣表型，表現(xiàn)為RPE細(xì)胞增厚、肥大(或營(yíng)養(yǎng)不良)、色素異常、氧化蛋白積聚等[21]。自噬激動(dòng)劑雷帕霉素能夠通過(guò)激活自噬，誘導(dǎo)清除受損線粒體，緩解AMD進(jìn)一步發(fā)展[22]。自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(或敲除 Beclin-1)通過(guò)抑制自噬增加了線粒體氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)脂褐素沉積，誘發(fā)RPE細(xì)胞凋亡[23]。研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍(AMP 依賴的蛋白激酶激動(dòng)劑)通過(guò)激活 AMP 依賴的蛋白激酶/mTOR信號(hào)通路，激活自噬從而緩解RPE細(xì)胞凋亡[24]。RS9(Nrf2 激動(dòng)劑)可通過(guò)激活A(yù)MP依賴的蛋白激酶/mTOR 通路促進(jìn)自噬，進(jìn)而激活 P62/Nrf2維持RPE細(xì)胞的功能[25]。趨化因子受體5通過(guò) PI3K/AKT 信號(hào)通路，抑制轉(zhuǎn)錄因子 FOXO1 的激活，從而調(diào)節(jié)RPE細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)和自噬調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)[26]。miR-29在RPE細(xì)胞中過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致p62降低、微管相關(guān)蛋白輕鏈3脂質(zhì)形式增加、自噬通量增加。此外，miR-29 通過(guò)靶向信使 RNA 的 3’-UTRs 轉(zhuǎn)錄后進(jìn)一步抑制mTORC1的活性，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬[27]。NF-κB 激活可誘導(dǎo) miR-24 表達(dá)降低，進(jìn)而激活A(yù)KT/mTOR信號(hào)通路抑制自噬,誘導(dǎo)RPE細(xì)胞功能障礙[28]。以上研究均表明，自噬對(duì)RPE細(xì)胞起著重要的保護(hù)作用，自噬功能障礙可能會(huì)加劇氧化應(yīng)激并導(dǎo)致干性AMD的發(fā)病，它可作為新的治療靶點(diǎn)。

3.3 細(xì)胞壞死性凋亡與干性AMD細(xì)胞壞死性凋亡是當(dāng)正常凋亡途徑被抑制時(shí)發(fā)生的一種替代性程序性細(xì)胞死亡。它主要由RIPK1、 RIPK3和混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣假激酶調(diào)節(jié)。RIPK1/ RIPK3介導(dǎo)后者的磷酸化，啟動(dòng)下游信號(hào)，誘導(dǎo)細(xì)胞壞死性凋亡[29]。

在AMD患者和小鼠中均能觀察到細(xì)胞腫脹、空泡等細(xì)胞壞死性凋亡的特征。在氧化應(yīng)激作用下，RPE細(xì)胞可檢測(cè)到細(xì)胞膜通透性降低、RIPK1 和 RIPK3 激活、細(xì)胞核高遷移率族蛋白1釋放[30]。dsRNA(玻璃膜疣的一種成分)能夠誘導(dǎo)視網(wǎng)膜壞死和炎癥反應(yīng)，而敲除 RIPK3 能夠降低細(xì)胞核高遷移率族蛋白1、腫瘤壞死因子-ɑ、IL-6 等炎癥因子含量，緩解視網(wǎng)膜壞死和炎癥反應(yīng)[31]。在不同AMD動(dòng)物模型中，RIPK1 抑制劑能保護(hù)RPE細(xì)胞免受壞死性凋亡的影響，維持了視網(wǎng)膜的視覺功能[32]，且具有良好的角膜滲透性，是臨床干性AMD治療候選藥物之一。4-乙酰氧基苯酚通過(guò)抑制 RIPK3 的激活，穩(wěn)定Nrf2，上調(diào) NQO1 和 HO-1 抗氧化基因表達(dá)，保護(hù)RPE細(xì)胞，避免發(fā)生氧化應(yīng)激所致的細(xì)胞壞死[33]。β-淀粉樣蛋白可以通過(guò)激活 Toll 樣受體4 (TLR4) /NF-κB 信號(hào)通路,誘導(dǎo) IL-6、IL-8 和 IL-33 等炎癥因子的表達(dá)，介導(dǎo)RPE細(xì)胞壞死性凋亡；COBRA (TLR4 抑制劑)可逆轉(zhuǎn)以上現(xiàn)象[34]。Klettner 等[35]研究發(fā)現(xiàn)，TLR3、TLR4 激動(dòng)劑和腫瘤壞死因子-ɑ 均能夠誘導(dǎo)RPE細(xì)胞分泌 IL-6 和 IL-8，降低RPE細(xì)胞活性和細(xì)胞功能，導(dǎo)致視網(wǎng)膜萎縮變性。以上研究均證實(shí)了細(xì)胞壞死性凋亡在干性AMD發(fā)病過(guò)程中起到關(guān)鍵性作用。

3.4 細(xì)胞焦亡與干性AMD細(xì)胞焦亡(也稱炎性壞死)是一種依賴于 Gasdermin 蛋白家族膜打孔功能的裂解性程序性細(xì)胞死亡，通常與 caspase 激活有關(guān)。細(xì)胞焦亡可由不同的炎癥小體介導(dǎo)，目前對(duì)NLRP3 研究最為廣泛。NLRP3 炎癥小體由 NLRP3、凋亡相關(guān)微粒蛋白和活化的 caspase-1 組成[36]。激活 NLRP3炎癥小體后，以蛋白水解的方式切割炎癥因子前體，如 IL-1β、IL-18、Gasdermin D 等，會(huì)誘發(fā)細(xì)胞焦亡。

2012年，人們首次研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3 與AMD相關(guān)[37]，從AMD患者眼球中分離出的玻璃膜疣成分可激活外周髓細(xì)胞和單核細(xì)胞中的 NLRP3 炎癥小體和 caspase-1,進(jìn)而促進(jìn) IL-1β 和 IL-18 的分泌。選擇性的 NLRP3 抑制劑 (IFM-514、IFM-632 和 CRID3) 可顯著抑制RPE細(xì)胞焦亡以及氧化損傷[38]。caspase-1 敲除小鼠視網(wǎng)膜炎癥反應(yīng)減少、光感受器細(xì)胞存活率升高、視網(wǎng)膜功能得到更好的保護(hù)[39]。Kerur等[40]研究發(fā)現(xiàn)，干性AMD患者和小鼠模型中可以檢測(cè)到 caspase-4、Gasdermin D 等含量升高。氧化型低密度脂蛋白能夠誘導(dǎo)RPE細(xì)胞 NLRP3、 caspase-1 和 IL-1β 的表達(dá)增加，而 INF39 (NLRP3 抑制劑) 能逆轉(zhuǎn)其誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡[41]。光氧化刺激RPE細(xì)胞可以促進(jìn)外泌體分泌，并通過(guò)上調(diào) NLRP3、IL-1β、IL-18 和 caspase-1 的表達(dá)加重細(xì)胞的氧化損傷以及焦亡[42]。microRNA-22-3p 通過(guò)直接靶向結(jié)合NLRP3，抑制 NLRP3 誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡，緩解AMD病程[43]。拉米夫定(核苷類似物逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑)通過(guò)抑制 NLRP3，顯著降低 RNA 誘導(dǎo)的人和小鼠RPE細(xì)胞 IL-18、IL-1β 和 p16 的表達(dá)，緩解RPE細(xì)胞衰老[44]。β-淀粉樣蛋白可以誘導(dǎo)RPE細(xì)胞產(chǎn)生腫脹、起泡、膜破裂等焦亡形態(tài)學(xué)特征，且伴隨著 IL-1β、IL-18 等細(xì)胞焦亡表型指標(biāo)增加，其機(jī)制可能通過(guò)激活 NLRP3/caspase-1/GSDMD-N 信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡；枸杞多糖則可通過(guò)抑制β-淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡緩解RPE細(xì)胞功能障礙[45]。Gao等[46]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞焦亡被激活時(shí)，X-連鎖凋亡抑制蛋白表達(dá)下調(diào)，其可能通過(guò)抑制 caspase-1/IL-1β/IL-18 信號(hào)通路抑制RPE細(xì)胞焦亡。花青素-3-葡萄糖苷[47]通過(guò)抑制 c-Jun氨基末端激酶/活化蛋白-1信號(hào)通路，抑制NLRP3、IL-1、IL-18 和 caspase-1 相關(guān)細(xì)胞焦亡基因的表達(dá)，從而減輕RPE細(xì)胞焦亡。以上體內(nèi)外研究均證實(shí)，細(xì)胞焦亡在AMD的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，抑制細(xì)胞焦亡可能成為治療或延緩AMD的新途徑。

3.5 細(xì)胞鐵死亡與干性AMD細(xì)胞鐵死亡是以鐵離子誘導(dǎo)的膜脂質(zhì)過(guò)氧化為特征的程序性細(xì)胞死亡。在二價(jià)鐵和脂氧合酶的作用下，催化細(xì)胞膜上高表達(dá)的不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化；同時(shí)由于膜脂修復(fù)酶GPx4失效，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[48]。其生物學(xué)特征主要為Fe2+濃度升高，GPx4 失活和谷胱甘肽濃度降低。

Hahn 等[49]研究發(fā)現(xiàn)，AMD患者視網(wǎng)膜中總鐵含量高于同齡健康人，鐵誘導(dǎo)生成的氧自由基參與AMD中RPE細(xì)胞的損傷過(guò)程。谷胱甘肽是RPE細(xì)胞中重要的抗氧化劑，AMD患者視網(wǎng)膜中谷胱甘肽含量顯著降低，并且伴隨著GPx4活性降低。RPE細(xì)胞中谷胱甘肽含量下降能夠誘導(dǎo)細(xì)胞鐵死亡、自噬和衰老，而給予鐵死亡抑制劑去鐵胺(抑制Fe2+)、鐵抑素-1(抑制脂質(zhì)過(guò)氧化)或補(bǔ)充谷胱甘肽能逆轉(zhuǎn)以上現(xiàn)象，說(shuō)明鐵死亡在AMD疾病進(jìn)展中的重要性[50]。AMD患者視網(wǎng)膜中視黃醛含量顯著升高，過(guò)量視黃醛可誘導(dǎo)光感受器細(xì)胞中?；o酶A合成酶長(zhǎng)鏈家族成員4表達(dá)升高，并可抑制溶質(zhì)載體家族7成員11，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)半胱氨酸含量降低，抑制谷胱甘肽合成，促進(jìn)脂質(zhì)過(guò)氧化，共同加速細(xì)胞鐵死亡[51]。硒蛋氨酸通過(guò)激活Nrf2進(jìn)而誘導(dǎo)其靶基因溶質(zhì)載體家族7成員11的表達(dá)[52]，增加細(xì)胞內(nèi)半胱氨酸的含量，增加谷胱甘肽合成，增強(qiáng)RPE細(xì)胞的抗氧化能力，緩解鐵死亡。黃芪甲苷作為一種潛在的視網(wǎng)膜保護(hù)劑，可通過(guò)抑制絲裂原活化蛋白激酶和 NF-κB 信號(hào)通路，進(jìn)而抑制RPE細(xì)胞中鐵離子調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白的表達(dá)，降低細(xì)胞內(nèi) Fe2+含量，抑制細(xì)胞鐵死亡[53]。因此，抑制鐵死亡可以作為治療干性AMD的新靶點(diǎn)。

4 總結(jié)與展望

RPE細(xì)胞發(fā)生程序性細(xì)胞死亡在干性AMD的病程發(fā)展中起著重要作用。凋亡、自噬、壞死性凋亡、焦亡和鐵死亡這5種程序性細(xì)胞死亡有可能成為治療干性AMD的新靶點(diǎn)。進(jìn)一步深入研究程序性細(xì)胞死亡與干性AMD的發(fā)病機(jī)制的關(guān)系至關(guān)重要，可為臨床AMD的早期診斷和治療提供理論依據(jù)。