全自動(dòng)氨基酸分析儀法同時(shí)測(cè)定復(fù)方α-酮酸片中的5種氨基酸含量

(煙臺(tái)市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，煙臺(tái) 264000)

復(fù)方α-酮酸片為多種酮酸、羥酸及氨基酸組成的復(fù)方制劑，臨床上主要用于治療慢性腎功能衰竭、延緩腎衰進(jìn)展、糾正代謝紊亂等。對(duì)于慢性腎衰患者，服用復(fù)方α-酮酸片可以有效的增加營(yíng)養(yǎng)，改善糖尿病腎病患者的腎功能，對(duì)血糖、血壓水平具有一定的控制作用，安全性較好[1，2]。該藥物的作用機(jī)理主要是通過(guò)減少飲食對(duì)蛋白的攝入，進(jìn)而減少體內(nèi)肌酐的合成速度，將非必需氨基酸轉(zhuǎn)化成為必需氨基酸，從而達(dá)到輔助治療的目的[3，4]。復(fù)方α-酮酸片中酮酸和羥酸以鈣鹽的形式存在，5種氨基酸分別為醋酸賴氨酸(lysine acetate，LYS)、蘇氨酸(threonine，THR)、色氨酸(tryptophan，TRY)、組氨酸(histidine，HIS)、酪氨酸(tyrosine，TYR)。文獻(xiàn)報(bào)道中，對(duì)于5種游離氨基酸的含量測(cè)定多使用柱前衍生化的方法，衍生試劑多采用2，4-二硝基氟苯(FDNB)、鄰苯二甲醛(OPA)和 2-巰基乙醇等，衍生化試劑毒性大，衍生過(guò)程對(duì)于時(shí)間和溫度的要求較為嚴(yán)苛，而衍生過(guò)程的優(yōu)異直接影響氨基酸含量測(cè)定結(jié)果[5-10]的準(zhǔn)確性。此外，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局收載的國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)于復(fù)方α-酮酸片中五種氨基酸的含量測(cè)定的方法描述，存在步驟復(fù)雜并需使用高性能的液相色譜儀、或描述簡(jiǎn)略、或無(wú)法同時(shí)測(cè)定五種氨基酸成分等問(wèn)題[11-13]。目前，隨著檢驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，全自動(dòng)氨基酸分析儀法因其自帶衍生系統(tǒng)，大大簡(jiǎn)化了樣品的處理步驟，有效降低了處理過(guò)程中產(chǎn)生的誤差，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于食品檢驗(yàn)、臨床檢驗(yàn)等方面[14-19]，但在藥品檢驗(yàn)行業(yè)還需進(jìn)一步擴(kuò)大和深入。文獻(xiàn)報(bào)道中對(duì)于復(fù)方α-酮酸片的測(cè)定多采用HPLC法、雖能同時(shí)測(cè)定5種氨基酸的含量，但實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需使用劇毒性的衍生試劑進(jìn)行衍生化操作，風(fēng)險(xiǎn)較大[7-10]。本試驗(yàn)建立的氨基酸分析儀的測(cè)定方法，消除了各樣品由于衍生時(shí)間和溫度等因素的差異帶來(lái)的誤差，不但能夠同時(shí)測(cè)定復(fù)方α-酮酸片中的5種氨基酸含量，而且還具有簡(jiǎn)單、快速、衍生劑不直接進(jìn)柱等優(yōu)點(diǎn)。

1 儀器和試劑

1.1 儀器

XPE205DR電子分析天平；S-433D氨基酸分析儀，包括自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)、泵系統(tǒng)、溫控分離及柱后衍生系統(tǒng)、檢測(cè)系統(tǒng)、工作站等；層析柱：陽(yáng)離子交換色譜柱 LCA K07/Li(4.6×150mm)。

1.2 試劑

醋酸賴氨酸對(duì)照品(批號(hào):140802-202003，含量99.8%)、色氨酸對(duì)照品(批號(hào)：140686-201904，含量99.9%)、蘇氨酸對(duì)照品(批號(hào)：140682-201302，含量99.9%)、鹽酸組氨酸對(duì)照品(批號(hào)：140693-201904，含量99.9%)、酪氨酸對(duì)照品(批號(hào)：140609-201914，含量99.9%)均購(gòu)自某食品藥品檢定研究院；17種氨基酸混標(biāo)液(批號(hào)：SLBZ9656)；茚三酮(貨號(hào)：S000027CN)購(gòu)自科學(xué)儀器公司。其他試劑均為分析純?cè)噭?。?fù)方α-酮酸片：藥業(yè)公司(批號(hào)：52006015，薄膜衣片，規(guī)格：每片0.63g)；復(fù)方α-酮酸片：醫(yī)藥公司(批號(hào)：81PA008、81PC087，薄膜衣片，規(guī)格：每片0.63g)。

2 方法和結(jié)果

2.1 測(cè)定條件

氨基酸分析儀的流動(dòng)相：A相為檸檬酸鋰(0.12 N，pH 2.90)、B相為檸檬酸鋰(0.2 N，pH 4.20)、C相為檸檬酸鋰(0.3 N，pH 8.00)，D相為鋰再生液(0.45 N/Li)；流速：緩沖泵0.45 mL/min，緩沖泵的梯度洗脫程序?yàn)椋? min：80% A + 20% B；3 min：79% A + 21% B；8 min：61% A + 39% B；20 min：43% A + 57% B；32 min：100% B；38 min：100% C；43 min：76% C + 24% D；57 min：76% C + 24% D；57.10 min：100% D；61.10 min：100% D，61.20 min：100% A；73 min：100% A。

柱溫箱溫度程序?yàn)椋? min：42 ℃；25 min：42 ℃；40 min：60 ℃；46 min：74 ℃；62 min：74 ℃；68 min：42 ℃；73 min：42 ℃。

茚三酮衍生泵流速為0.25 mL/min，時(shí)間為60 min，反應(yīng)器溫度為130 ℃。

檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器，波長(zhǎng)為570 nm和440 nm。進(jìn)樣量50 μL。

2.2 溶液的制備

對(duì)照品溶液的制備 分別取醋酸賴氨酸對(duì)照品、蘇氨酸對(duì)照品、色氨酸對(duì)照品、鹽酸組氨酸對(duì)照品、酪氨酸對(duì)照品，精密稱定，加20 mol·L-1的鹽酸溶液溶解并稀釋制成濃度為醋酸賴氨酸1065.1 mg·L-1、蘇氨酸586.2 mg·L-1、色氨酸244.0 mg·L-1、組氨酸386.3 mg·L-1、酪氨酸300.7 mg·L-1的混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。精密量取2 mL置100 mL量瓶中，加20 mol·L-1的鹽酸溶液至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

供試品溶液的制備 取本品適量，研細(xì)，精密稱取細(xì)粉10.52 mg，置100 mL量瓶中，加20 mol·L-1的鹽酸溶液至刻度，搖勻作為供試品儲(chǔ)備溶液。精密量取2 mL置10 mL量瓶中，加20 mol·L-1的鹽酸溶液至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

空白輔料溶液：按處方精密稱取不含上述5種氨基酸的空白輔料，置100 mL容量瓶中，加20 mol·L-1的鹽酸溶液60ml，超聲15 min，放冷，用20 mol·L-1的鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性及專屬性試驗(yàn)

分別取2.2節(jié)的對(duì)照品溶液、混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液、供試品溶液按2.1節(jié)的色譜條件，進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，見圖1。從圖1A、B可以看出，在2.1所示色譜分析條件下，混合對(duì)照品中的五種氨基酸和供試品中的五種氨基酸均能實(shí)現(xiàn)基線分離，且分離度均大于1.5。圖1C顯示，空白輔料中不存在干擾峰，可見本品的其它組份及試劑對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。結(jié)果表明，在該氨基酸分析儀的分析條件下，其他成分對(duì)復(fù)方α-酮酸片中的5種氨基酸成分的含量測(cè)定無(wú)干擾，表明所用方法的專屬性良好 。

圖1 復(fù)方α-酮酸片及氨基酸混標(biāo)溶液的圖譜1.混合對(duì)照品溶液；B.供試品溶液；C.空白輔料

2.4 線性關(guān)系考察

取2.2中的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，分別精密量取0.5 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL置100 mL量瓶中，加20 mol·L-1的鹽酸溶液稀釋至刻度。按2.1的測(cè)定條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖峰面積，以峰面積(Y)對(duì)各組分的進(jìn)樣量(X，mg·L-1)進(jìn)行線性回歸，利用最小二乘法計(jì)算所得的回歸方程見表1。

表1 5種氨基酸的線性回歸方程統(tǒng)計(jì)

2.5 精密度考察

精密吸取2.2中的對(duì)照品溶液，按2.1的測(cè)定條件進(jìn)行測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，測(cè)得的各氨基酸的峰面積平均值和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見表2。表中數(shù)值顯示，6次測(cè)量的峰面積的精密度均在0.3% ～ 0.5%之間，符合《中國(guó)藥典》2020版關(guān)于方法精密度的要求。

表2 5種氨基酸混合對(duì)照品溶液的精密度測(cè)試結(jié)果(n=6)

2.6 重復(fù)性和重現(xiàn)性考察

取同一批號(hào)的復(fù)方α-酮酸片(批號(hào)81PA008)，按照2.2的方法，平行制備6份供試品溶液，分別按照2.1的測(cè)定條件進(jìn)行測(cè)定。測(cè)得該批供試品中各氨基酸的結(jié)果如下：醋酸賴氨酸的平均含量為101.3%，RSD為1.2%；蘇氨酸的平均含量為99.8%，RSD為0.6%；色氨酸的平均含量為98.0%，RSD為1.6%；組氨酸的平均含量為102.9%，RSD為0.8%；酪氨酸的平均含量為98.0%，RSD為0.6%。請(qǐng)另一名試驗(yàn)人員精密稱取同批次復(fù)方α-酮酸片，按照2.2的方法平行制備6份供試品溶液，按照2.1的測(cè)定條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得醋酸賴氨酸、蘇氨酸、色氨酸、組氨酸、酪氨酸的平均含量分別為：100.4%、99.6%、98.1%、102.6%、98.4%；RSD(n=6)分別為1.3%、0.5%、1.2%、0.6%、0.4%，均小于2.0%，重現(xiàn)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一批號(hào)(81PA008)的復(fù)方α-酮酸片，按照2.2的方法配制供試品溶液，分別于配制后 0、2、4、8、16、24 h 進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得醋酸賴氨酸、蘇氨酸、色氨酸、組氨酸、酪氨酸的平均峰面積分別為7923.094、6515.556、1375.456、3483.213、2279.894；RSD分別為0.6%、0.4%、0.8%、0.5%、0.2%。結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 回收率試驗(yàn)

采用加樣回收試驗(yàn)進(jìn)行回收率測(cè)定，精密量取已知準(zhǔn)確含量的同批供試品儲(chǔ)備液9份，每份各精密量取2 mL，每3份分別按“1.2∶1，1∶1，0.8∶1”的比例，精密加入適量的氨基酸對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。計(jì)算回收率，結(jié)果見表3。利用該方法進(jìn)行氨基酸測(cè)定時(shí)，復(fù)方α-酮酸片中5種氨基酸的平均回收率及RSD分別為：蘇氨酸平均回收率99.3%，RSD為1.4%；酪氨酸平均回收率102.9%，RSD為2.0%；組氨酸的平均回收率為98.2%，RSD為1.5%；色氨酸的平均回收率為101.9%，RSD為1.2%；醋酸賴氨酸的平均回收率為99.1%，RSD為1.0%。

表3 復(fù)方α-酮酸片中5種氨基酸的回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

續(xù)表3

2.9 樣品的含量測(cè)定

取3批樣品，按2.2的方法制備供試品溶液和對(duì)照品溶液，按照2.1的方法進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，以峰面積按外標(biāo)法進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果見表4。

表4 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 討論

本研究建立了氨基酸分析儀法同時(shí)測(cè)定復(fù)方α-酮酸片中5種氨基酸的分析方法。該方法不再使用高劇毒的衍生化試劑、也不需要采用柱前衍生的自動(dòng)進(jìn)樣操作；操作簡(jiǎn)單方便、效率高、成本低。

方法學(xué)試驗(yàn)結(jié)果表明該方法對(duì)5種氨基酸能夠?qū)崿F(xiàn)完全的基線分離，專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好，且不受其他成分，如操作中帶入的碳水化合物等的干擾。結(jié)果準(zhǔn)確可靠，精密度與線性關(guān)系均良好，可用于復(fù)方α-酮酸片的質(zhì)量控制。