環(huán)狀RNA在妊娠期高血壓患者中的表達(dá)及潛在作用機(jī)制

王健，史云，顧秀峰，李玉明，胡金朋

美國婦產(chǎn)科醫(yī)師學(xué)會發(fā)布的“妊娠期高血壓和子癇前期指南2019版”，妊娠期高血壓是指妊娠第20周后新發(fā)生的收縮壓和/或舒張壓≥140/90 mmHg，分娩后血壓可恢復(fù)正常，妊娠期高血壓是妊娠期嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，可引起母嬰的不良結(jié)局[1]。每年約有5萬余名孕婦死于妊娠期高血壓，但其確切發(fā)生機(jī)制仍未闡明。目前認(rèn)為反復(fù)的缺氧/缺血和再灌注、淺層滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤、反應(yīng)性氧化產(chǎn)物增多、全身炎癥、上皮功能障礙和血栓形成等是妊娠期高血壓的病理基礎(chǔ)[2]。臨床上多采用解痙、擴(kuò)容、降壓等對癥治療，但是除終止妊娠外，尚無有效的治愈手段[3]。由于分娩是治愈妊娠期高血壓的唯一方法，因此有些學(xué)者認(rèn)為胎盤結(jié)構(gòu)和功能的改變與妊娠期高血壓的發(fā)病有關(guān)。胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞承擔(dān)著大部分的胎盤交換、內(nèi)分泌和屏障功能，對滋養(yǎng)層細(xì)胞生物學(xué)行為調(diào)控因子的研究可能有利于幫助我們理解妊娠期高血壓的發(fā)病機(jī)制。近年來，環(huán)狀RNA(circular RNA, circRNA)作為一種潛在的關(guān)鍵調(diào)控因子受到了廣泛關(guān)注。circRNA與傳統(tǒng)的線性RNA不同，分子呈封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不受RNA外切酶影響，富含微小RNA(micro RNA, miRNA)結(jié)合位點(diǎn)，可解除miRNA對其靶基因的抑制作用，升高靶基因的表達(dá)水平，在疾病中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。circRNA數(shù)量龐大，通過尋找其調(diào)控通路中的關(guān)鍵基因節(jié)點(diǎn)對于探索妊娠期高血壓的發(fā)病機(jī)制及制定妊娠期高血壓治療的臨床策略具有重要意義和指導(dǎo)作用[4]。因此本研究挑選妊娠期高血壓患者和正常妊娠的胎盤組織，采用lncRNA高通量測序篩選出2組樣本間的差異表達(dá)circRNA，并根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測與其作用的靶基因。

1 材料與方法

1.1 組織樣本收集 選取6名妊娠期高血壓患者和6名健康孕產(chǎn)婦作為研究對象，分為妊娠期高血壓組(M組)和健康對照組(C組)，各組的胎盤組織標(biāo)本均于胎盤娩出后5 min內(nèi)，在距離臍帶附著點(diǎn)2 cm處的胎盤母體面同一部位取1 cm×1 cm×1 cm組織，無菌磷酸鹽緩沖液沖洗后于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 妊娠期高血壓組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)30～35歲的初產(chǎn)婦，且為單胎妊娠；(2)妊娠20周及以后孕期新發(fā)生的高血壓，即收縮壓≥140 mmHg和/或舒張壓≥90 mmHg；(3)無其他基礎(chǔ)疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)胎兒發(fā)育畸形；(2)胎膜早破或羊水過多；(3)非自然受孕：(4)產(chǎn)后3個月內(nèi)血壓仍未恢復(fù)正常。健康對照組納入標(biāo)準(zhǔn)：無其他基礎(chǔ)疾病的30～35歲的初產(chǎn)婦，且為單胎妊娠，孕期血壓正常。排除標(biāo)準(zhǔn)同妊娠期高血壓組的排除標(biāo)準(zhǔn)(1)(2)(3)。

1.3 樣本處理及RNA提取 (1)從每名產(chǎn)婦的胎盤組織中均取材0.1 cm×0.1 cm×0.1 cm大小組織。將組內(nèi)6名患者的樣本加入至離心管內(nèi)混合在一起后，向離心管內(nèi)加入1.5 mL Trizon和0.3 mL氯仿，組織破碎儀以2 000次/分鐘的頻率破碎組織，冰盒上放置5 min。4 ℃、12 000 rpm離心15 min，把水相層轉(zhuǎn)移到一個新的預(yù)冷1.5 mL RNase-Free離心管中。加入等體積預(yù)冷的70%乙醇，顛倒混勻后加入到已裝入收集管的吸附柱RM中，在4 ℃，12 000 rpm離心30 s，棄去管內(nèi)液體。加入700 μL RW1洗滌沉淀，4 ℃，12 000 rpm離心30 s，棄流出液。加入500 μL RW2洗滌沉淀。4 ℃，12 000 rpm離心30 s，棄去管內(nèi)液體。隨后離心2 min，使吸附柱內(nèi)液體充分分離，冰盒上放置5 min，晾干。將吸附柱放入到一個新的1.5 mL RNase-Free離心管中，加入35 μL無RNase水后靜置3 min，4 ℃，12 000 rpm離心1 min。得到的RNA保存在-80 ℃冰箱中，防止降解。(2)從M組和C組的RNA樣本中各取15 μL，等分為3份，每份5 μL。按照試劑盒說明書將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA。配置25 μL反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃15 s和60 ℃ 1 min共40個循環(huán)，然后0.3 ℃梯度升溫用于熔解曲線分析。使用2-ΔΔCt方法計算相對表達(dá)水平。

1.4 高通量測序檢測circRNA表達(dá)水平

1.4.1 分布特點(diǎn)評估 使用BWA-MEM軟件將樣本質(zhì)控后的測序序列與參考基因組進(jìn)行比對，然后采用CIRI2軟件來鑒定circRNA，并使用BEDtools數(shù)據(jù)包根據(jù)circRNA的位置信息和基因注釋信息來確定circRNA分布。

1.4.2 circRNA差異表達(dá)分析 每組樣本設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，先采用TMM軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，之后用DEGseq軟件進(jìn)行差異分析。為了得到顯著差異的基因，將篩選條件設(shè)為：qValue<0.05且差異倍數(shù)|FoldChange|>2。

1.4.3 差異circRNA對應(yīng)靶基因的富集分析 應(yīng)用R軟件的igraph package數(shù)據(jù)包，預(yù)測差異表達(dá)circRNA對應(yīng)的宿主基因，并通過DAVAD軟件將其進(jìn)行基因本體論(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析，選取P值<0.05的通路進(jìn)行展示。

2 結(jié)果

2.1 circRNA分布 以序列長度區(qū)分circRNA，可見長度在200～400 bp的circRNA分布較多；以包含外顯子數(shù)量來區(qū)分circRNA，可見包含2～4個外顯子的circRNA數(shù)量最多，分布情況見圖1。

1A 長度分布情況 1B 外顯子含量分布情況圖1 circRNA分布情況

2.2 差異circRNA表達(dá)結(jié)果 2組樣本共有43個差異circRNA，其中下調(diào)的circRNA有20個，上調(diào)的circRNA有23個。差異倍數(shù)最大的3個circRNA分別是circRNA00907、circRNA00427、circRNA00420。見表1。

表1 差異circRNA表達(dá)結(jié)果

續(xù)表1

2.3 靶基因GO富集分析 GO富集分析顯示，主要富集的生物學(xué)過程為生物過程的正調(diào)控、細(xì)胞過程的正調(diào)控、多生物過程、生殖過程、白細(xì)胞激活；主要富集的細(xì)胞組分是胞外區(qū)、囊泡、膜的側(cè)面、細(xì)胞表面、質(zhì)膜外側(cè)；主要富集的分子功能是信號受體結(jié)合、抗原結(jié)合、激素活性、免疫球蛋白受體結(jié)合、受體配體活性。見圖2。

注：紅色為主要富集的生物學(xué)過程，藍(lán)色為主要富集的細(xì)胞組分，黃色為主要富集的分子功能圖2 靶基因GO富集分析

2.4 靶基因KEGG通路富集分析 靶基因主要富集的信號通路中，僅氨酸激酶-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子(janus kinase-signal transducer and activator of transcription, JAK-STAT)信號通路的富集差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，矯正后P=0.039。

2.5 JAK2和STAT3的mRNA表達(dá)差異 與C組比較，M組患者標(biāo)本中JAK2的mRNA表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(2.34±0.25 vs 1.02±0.18,P<0.05)；STAT3的mRNA表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(1.56±0.21 vs 1.05±0.11,P<0.05)。

3 討論

妊娠期高血壓是一種不可預(yù)測的影響患者多個系統(tǒng)的綜合征，與心血管并發(fā)癥和糖尿病的高風(fēng)險相關(guān)[5]。妊娠期高血壓如果控制不佳，可迅速發(fā)展為危及生命的子癇。然而由于妊娠期高血壓的病因仍未闡明，目前臨床上對妊娠期高血壓患者有效的治療方法很少，唯一有效方法是分娩胎兒和胎盤，這可以減少母體心血管系統(tǒng)中的促炎物質(zhì)[6]。妊娠期高血壓的病理生理主要包括胎盤異常、螺旋動脈重構(gòu)異常、胎盤功能不全和內(nèi)皮功能障礙等。早發(fā)型妊娠期高血壓與滋養(yǎng)細(xì)胞中螺旋動脈的生理轉(zhuǎn)化改變有關(guān)，研究[7]顯示，妊娠期高血壓的胎盤常伴有胎盤梗塞和動脈硬化，從而導(dǎo)致胎盤灌注減低，而這與滋養(yǎng)層細(xì)胞浸潤改變導(dǎo)致胎盤缺血相關(guān)。在健康妊娠婦女中，胎兒來源的絨毛外細(xì)胞滋養(yǎng)層侵入蛻膜和子宮肌層的螺旋動脈，隨后這些螺旋動脈失去其內(nèi)皮性質(zhì)，從高阻力血管轉(zhuǎn)變?yōu)榇笱埽軌蛱峁┳銐虻奶ケP灌注，為發(fā)育中的胎兒提供營養(yǎng)[8-9]。但這種螺旋重塑在妊娠期高血壓患者中常被破壞，由于螺旋動脈重塑受損，可導(dǎo)致胎盤缺血、缺氧，并有利于產(chǎn)生抗血管生成因子進(jìn)入母體循環(huán)，從而導(dǎo)致內(nèi)皮損傷[10]。目前，越來越多的證據(jù)支持滋養(yǎng)層淺表含義理論，即滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲功能障礙導(dǎo)致妊娠期高血壓的發(fā)生和發(fā)展。隨著基因組測序和基因芯片技術(shù)的發(fā)展，研究[11]發(fā)現(xiàn)人類基因組中可以翻譯成蛋白質(zhì)的基因僅占1%～2%，還有大量的不能轉(zhuǎn)錄成蛋白質(zhì)的基因存在且在各種復(fù)雜的生物學(xué)過程中發(fā)揮作用，即非編碼RNA，而circRNA就是其中的一種。研究[12]表明，circRNA的表達(dá)差異與滋養(yǎng)細(xì)胞的功能密切相關(guān)，提示其靶基因可能成為妊娠期高血壓早期診斷和提示預(yù)后生物標(biāo)志物，亦可能作為機(jī)制研究的突破口。

本研究發(fā)現(xiàn)共有43條circRNA存在表達(dá)差異，其靶向宿主基因的富集分析提示相關(guān)基因主要在細(xì)胞核外發(fā)揮作用，參與的生物學(xué)過程多與調(diào)控抗原與受體結(jié)合有關(guān)。富集的信號通路主要為JAK-STAT信號通路，它是近年來發(fā)現(xiàn)的一條由細(xì)胞因子刺激的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等許多重要的生物學(xué)過程[13]，使得細(xì)胞外的化學(xué)信號跨越細(xì)胞膜并將信息傳送到細(xì)胞核內(nèi)DNA上的基因啟動子上，最終引起細(xì)胞中DNA轉(zhuǎn)錄與活性水平發(fā)生改變，當(dāng)JAK-STAT信號通路的功能失調(diào)可導(dǎo)致多種疾病。與其它信號通路相比，這條信號通路的傳遞過程相對簡單，它主要由三個成分組成，即酪氨酸激酶相關(guān)受體、酪氨酸激酶JAK和轉(zhuǎn)錄因子STAT。JAK-STAT系統(tǒng)是除了第二信使系統(tǒng)外最重要的信號途徑[14]。有研究[15]顯示JAK-STAT信號通路的激活可能促進(jìn)PE的發(fā)病，與本研究結(jié)果類似。

綜上所述，本研究通過臨床樣本，檢測了妊娠期高血壓患者和正常產(chǎn)婦胎盤組織中circRNA的表達(dá)差異，并對其宿主基因進(jìn)行了富集分析，為妊娠期高血壓的發(fā)病機(jī)制研究提供了一定的參考。