間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體與心血管疾病的研究進(jìn)展

譚鑫，劉一如，康品方

心血管疾病是一種常見病、多發(fā)病，且致殘率和病死率很高。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是應(yīng)用最廣泛的心臟疾病臨床試驗干細(xì)胞。過去認(rèn)為移植的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化成心肌細(xì)胞和支持細(xì)胞類型來修復(fù)心臟組織，然而，許多觀察結(jié)果在生理上和時間上都不支持這種說法，于是出現(xiàn)了另一種說法，即移植的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞通過分泌旁分泌因子，進(jìn)一步促進(jìn)組織修復(fù)，從而來介導(dǎo)其治療效果，目前有越來越多的證據(jù)支持MSCs以旁分泌方式起到其功能作用，如MSCs來源外泌(MSC-EXs)體可單獨作用與心肌修復(fù)，且在修復(fù)受損心肌方面優(yōu)于MSCs[1]。許多研究[2]表明，通過干細(xì)胞治療激活的心肌保護(hù)通路，也可以通過注射干細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體來激活。

1 間充質(zhì)干細(xì)胞概述

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是骨髓細(xì)胞中的一類，由于它們可以快速粘附在組織培養(yǎng)皿上,所以可以從其他骨髓來源的單核細(xì)胞中分離出來，MSCs約占有核細(xì)胞的0.001%～0.1%，可以在體外大量擴(kuò)增而不喪失功能或表型。目前普遍認(rèn)為MSCs可表達(dá)CD44、CD29、CD73、CD90和CD105，以及CD106、CD166、ICAM-1,但不表達(dá)造血標(biāo)志物CD45、CD34、CD14、CD79a、CD11b和HLA-DR。在富含生長因子的選擇性培養(yǎng)基中，MSCs能夠分化為多種中胚層譜系和分化細(xì)胞類型，包括成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞/肌管、胰島細(xì)胞和心肌細(xì)胞等。而在體內(nèi)，它們已被證明可以移植并轉(zhuǎn)分化為心肌細(xì)胞，修復(fù)梗死的心肌細(xì)胞。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，MSCs可以改善心功能,但不只是通過替換受損的心肌細(xì)胞。MSCs還分泌多種細(xì)胞因子和生長因子，這些因子以可溶性形式釋放，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體能對心肌產(chǎn)生多種作用，如改善血管生成、刺激心肌干細(xì)胞和減少心肌細(xì)胞死亡。也有證據(jù)表明其能促進(jìn)成纖維細(xì)胞活化，調(diào)節(jié)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答和減輕心肌纖維化。

2 間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體與心血管疾病

大量研究[3-5]表明，外泌體分泌的旁分泌因子在保護(hù)心臟過程中起到重要的作用。在小鼠心臟缺血/再灌注損傷(I/R)模型中，在再灌注前用MSC來源的外泌體治療可顯著減小梗死面積[6]。再灌注前用MSCs對小鼠進(jìn)行體內(nèi)治療，顯示出生物能的提高和氧化應(yīng)激的降低，再灌注30 min后，經(jīng)外泌體處理小鼠的ATP/ADP和NADH/NAD+比值顯著升高。此外，外泌體治療24 h后局部和全身炎癥明顯減少[7]。而人類間充質(zhì)干細(xì)胞源性外泌體(hMSC-Exo)已在多個模型中被證明可減少I/R。抑制I/R誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和自噬在hMSC-Exo的心臟保護(hù)作用中起關(guān)鍵作用[8]。I/R損傷后細(xì)胞凋亡的主要特征是ATP生成減少、氧化應(yīng)激增加和細(xì)胞凋亡。在這種情況下，缺氧會抑制有氧呼吸和ATP的產(chǎn)生，使無氧糖酵解成為ATP產(chǎn)生的主要來源。ATP生成減少是心肌缺血損傷時心肌細(xì)胞死亡的一個重要特征。MSC-Exo包含糖酵解ATP生成階段所需要的五種酶，因此研究人員推測，MSC-Exo可以增加心肌細(xì)胞中ATP的生成，并減弱其缺血后凋亡。與此推測一致，外泌體治療可以恢復(fù)能量消耗，從而抑制心肌I/R損傷后細(xì)胞的死亡。此外，在MSC-Exo中存在的過氧化物酶和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶能夠降低氧化應(yīng)激，而氧化應(yīng)激是導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡的一個重要原因。自噬可以通過降解受損的細(xì)胞器來產(chǎn)生ATP，從而在輕度缺血應(yīng)激條件下維持細(xì)胞活力，但在嚴(yán)重缺血條件下，自噬會促進(jìn)細(xì)胞死亡，使心臟功能惡化。Xiao等[9]發(fā)現(xiàn)心肌梗死后MSC移植的有益部分是由于通過主要含有miR-125b-5p的外泌體提高了自噬通量。此外，基質(zhì)衍生因子1(SDF1a)在心肌梗死(MI)后具有心臟修復(fù)功能。有研究證明SDF1在MSCs來源的外泌體中過表達(dá)抑制缺血心肌細(xì)胞自噬，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞微血管生成，即SDF1過表達(dá)的MSCs釋放的外泌體對缺血性心肌梗死具有有益作用[10]。總之，現(xiàn)有的研究表明，通過改善ATP消耗和刺激通路來抑制凋亡，MSC-Exo為心肌細(xì)胞提供了一個短時間窗口，使其有機(jī)會恢復(fù)功能障礙。急性心肌梗死由于心肌細(xì)胞再生不足而導(dǎo)致心力衰竭，因此，促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖是心功能恢復(fù)的關(guān)鍵。細(xì)胞周期的誘導(dǎo)和抑制心肌細(xì)胞增殖基因的下調(diào)可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞重新進(jìn)入增殖狀態(tài)。MicroRNA譜分析顯示，MSC外泌體治療后心肌細(xì)胞中一組MicroRNA發(fā)生了顯著變化[11]。Hsa-miR-590-3p能夠下調(diào)抑制細(xì)胞增殖的基因如Hopx的表達(dá)，在心肌增殖中具有良好的應(yīng)用前景?；谛募〖♀}蛋白(cTnI)在梗死區(qū)微環(huán)境中的高表達(dá)，Wang等[12]利用基因轉(zhuǎn)染在間充質(zhì)干細(xì)胞表面表達(dá)cTnI靶向短肽，獲得cTnI靶向外泌體。這些外泌體可沿cTnI濃度梯度定位于梗死區(qū)。攜帶hsa-miR-590-3p的外泌體被心肌細(xì)胞內(nèi)吞，從而促進(jìn)心肌細(xì)胞在梗死周圍區(qū)域的增殖，最終恢復(fù)心功能。此外，GATA結(jié)合蛋白4表達(dá)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化，減少缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，改善梗死后心肌功能[13]。最新研究發(fā)現(xiàn)，Peng等[4]通過利用MSCs源性的外泌體miR-25-3p治療心肌梗死，發(fā)現(xiàn)其是通過靶向促凋亡蛋白從而抑制心肌梗死。

3 間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體與血管再生

間充質(zhì)干細(xì)胞通過分泌許多影響內(nèi)皮細(xì)胞生長和血管再生的蛋白從而促進(jìn)血管生成，包括血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和肝細(xì)胞生長因子 (HGF)[14]。然而，有證據(jù)表明外泌體也介導(dǎo)了這一促血管生成機(jī)制的一部分[15]，Gong等[16]從MSC細(xì)胞系C3H10T1/2中分離出外泌體，發(fā)現(xiàn)外泌體在體外刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖。Shabbir等[17]發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體在體外刺激內(nèi)皮細(xì)胞的形成，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖和遷移，另有研究[18]發(fā)現(xiàn)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體在I/R損傷時能保護(hù)皮瓣，誘導(dǎo)新生血管形成。最后，Hu等[19]證明MSC外泌體能夠增強(qiáng)小鼠后肢缺血模型的微血管密度和血液灌注，通過超濾和密度梯度純化從而誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分離出外泌體，并進(jìn)一步證實其在體外刺激內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖和成管。關(guān)于間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體刺激血管生成的機(jī)制，很多研究都集中在其外泌體的miRNA上。Liang等[20]發(fā)現(xiàn)miR-125a在脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體中富集，并且通過抑制DLL4促進(jìn)血管生成，Gong等[16]通過實驗發(fā)現(xiàn)miR-30b在體外對刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖具有重要作用，在裸鼠體內(nèi)皮下注射的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)miR-132外泌體預(yù)處理可顯著提高其體內(nèi)血管生成能力[21]，最近的研究[22]表明，MSC-Exo通過microRNA-126過表達(dá)，同時通過PI3K/Akt信號通路促進(jìn)血管生成。Chen等[23]發(fā)現(xiàn)MSC-Exo通過miR-672對骨骼再生過程中的血管生成起正向調(diào)節(jié)作用?？偟膩碚f，刺激血管生成的促血管生成miRNA的特性可能取決于MSC的來源，并且很可能隨著實驗?zāi)Ｐ偷牟煌兓Ｈ欢治雠囵B(yǎng)細(xì)胞釋放的外泌體中的miRNA相當(dāng)困難，不僅因為其產(chǎn)量低，還因為血清或細(xì)胞培養(yǎng)中添加的其他物質(zhì)中含有的miRNA可能相互影響[24]。

4 間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體與免疫調(diào)節(jié)

心血管疾病與免疫系統(tǒng)密切相關(guān)，淋巴細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞等參與了心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展。間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體可誘導(dǎo)受損組織的修復(fù)，并對不同淋巴細(xì)胞的分化、活化和功能發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，而骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體可能在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，它們抑制幾種免疫細(xì)胞的增殖。在B淋巴細(xì)胞中，它們通過調(diào)控相關(guān)基因mRNA的差異表達(dá)來調(diào)節(jié)細(xì)胞功能[25]。有證據(jù)表明，AFSC條件培養(yǎng)基(不含外泌體)的主要作用是誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡，而AFSC來源的外泌體會降低淋巴細(xì)胞的增殖[26]。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體通過增加調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例，降低輔助性T細(xì)胞17的比例，對體外T細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)作用[27]。胎兒肝臟MSC衍生的外泌體能夠抑制NK細(xì)胞的增殖、活化和細(xì)胞毒性[28]。研究[29]發(fā)現(xiàn)，MSCs發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的一種方式是釋放脂質(zhì)信號分子前列腺素E2，作為脂質(zhì)，前列腺素被發(fā)現(xiàn)與外泌體的脂膜有關(guān)。然而，前列腺素E2是否參與間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的免疫抑制機(jī)制尚未被研究。Sun等[30]通過小鼠腹腔注射阿霉素，建立擴(kuò)張型心肌病模型，并靜脈注射MSC-Exos，證明了MSC-Exos依賴于JAK2-STAT6通路介導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化，MSC-Exos通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的極化，改善擴(kuò)張型心肌病的炎癥微環(huán)境，有望為擴(kuò)張型心肌病的臨床治療提供希望。另外Zhao[31]實驗發(fā)現(xiàn)，MSC-Exo通過miR-182改變巨噬細(xì)胞活化狀態(tài)，從而減輕小鼠心肌I/R損傷。

5 外泌體的吸收

外泌體吸收效率與細(xì)胞內(nèi)微環(huán)境活性有關(guān)，這為缺血組織外泌體的聚集提供了一種機(jī)制，MSC外泌體優(yōu)先被細(xì)胞內(nèi)pH值較低的缺血心肌細(xì)胞內(nèi)吞。盡管有明確證據(jù)表明未成熟心肌細(xì)胞能夠吸收外泌體，但外泌體能夠進(jìn)入心肌細(xì)胞并將miRNA等物質(zhì)傳遞給心肌細(xì)胞的具體機(jī)制尚不清楚。只有少數(shù)研究對此進(jìn)行了實驗，事實上，心肌細(xì)胞對外泌體的攝取相對較少[32-34]。體內(nèi)心肌細(xì)胞攝取外泌體的證據(jù)更加有限，主要局限于基因表達(dá)改變的間接表現(xiàn)，這可能是由于miRNA的傳遞，但同樣也可能是外泌體表面蛋白激活受體的反應(yīng)。另一種可能是外泌體作用于內(nèi)皮細(xì)胞 ,因為這些細(xì)胞可以吸收所有類型的外泌體，包括MSC外泌體。此外，在一些實驗中，外泌體甚至可能不是直接作用于心肌，而是作用于巨噬細(xì)胞或單核細(xì)胞。

心血管疾病領(lǐng)域的外泌體研究尚處于起步階段，迄今為止對此類問題的研究相對較少，這可能是由于缺乏相關(guān)知識或在研究外泌體方面存在技術(shù)困難所致。為了充分理解外泌體的裝載、靶向和傳遞的生物學(xué)機(jī)制，以及為了確定外泌體中的內(nèi)源性物質(zhì)，需要進(jìn)行更深入的研究。