視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤動物模型建立方法的研究進(jìn)展

李 韻，李 娜(綜述)，李 恒，白夢天*(審校)

(1.四川省遂寧市中心醫(yī)院腫瘤中心，四川 遂寧 629000;2.四川省遂寧市中心醫(yī)院眼科中心，四川 遂寧 629000)

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(retinoblastoma,RB)是幼兒常見的眼內(nèi)惡性腫瘤。在發(fā)達(dá)國家，超過90%的RB患兒可獲得良好預(yù)后且具備良好的視功能，我國RB患兒的長期生存率僅有63%，而在其他落后國家與地區(qū)，RB患兒病死率竟高達(dá)50%～70%[1]。迫切地需要建立統(tǒng)一規(guī)范的早期診斷策略與有效的治療方案，以期降低全球RB患兒平均病死率、延長生存時(shí)間以及改善視功能。動物模型不僅在促進(jìn)深入認(rèn)識RB發(fā)病機(jī)制與分子遺傳學(xué)上發(fā)揮了重要作用，也為RB的早期診斷及治療方案的不斷優(yōu)化提供了有力的保障。構(gòu)建RB動物模型需考慮模型的有效性、遺傳性、生物穩(wěn)定性、宿主動物內(nèi)的免疫原性、系統(tǒng)的可預(yù)測性、可重復(fù)性以及模型動物的生存時(shí)間等問題[2-3]。當(dāng)前，RB動物模型的構(gòu)建方式主要有三種：①異種植入的移植瘤RB模型；②轉(zhuǎn)基因的RB模型；③基因敲除RB模型。然而，目前尚沒有一種造模方法能夠完美地模擬人類RB的發(fā)生及發(fā)展，不同動物模型均存在各自的特點(diǎn)及局限性。因此，筆者將對異種植入的移植瘤RB模型、轉(zhuǎn)基因的RB模型、基因敲除RB模型進(jìn)行綜述。

1 異種植入的移植瘤RB模型

目前，已有多種構(gòu)建RB移植瘤動物模型的方法被報(bào)道。常用的模型動物為小鼠、新生SD大鼠、斑馬魚及新西蘭白兔等，而嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠(severe combined immunodeficiency mice，SCID mice)成功率較高(68.8%)[4]。此外，由于兔眼同人眼具有相似的容積，因此兔眼常用于RB移植瘤影像學(xué)研究。目前，最常用的RB細(xì)胞注射方法為前房注射、玻璃體腔注射以及視網(wǎng)膜間隙下注射。使用前房注射RB細(xì)胞操作簡單，且能較好地觀察和取材腫瘤，但前房的物理和免疫環(huán)境均不同于眼后段[5]。盡管采用視網(wǎng)膜下間隙注射法可確保RB細(xì)胞在眼后段生長，但該法技術(shù)要求高，腫瘤不易直接觀察，常需構(gòu)建熒光蛋白進(jìn)行示蹤[6]，且在操作中極易損傷脈絡(luò)膜和視網(wǎng)膜。近年來，Xiong等[7]采用皮下注射法構(gòu)建模型，該法造模方法簡單，操作風(fēng)險(xiǎn)低，但常引起視網(wǎng)膜之外的腫瘤發(fā)生。而玻璃體腔注射法操作相對簡單，可較好地模擬腫瘤生長環(huán)境，并且觀察腫瘤相對方便，因此成為目前運(yùn)用最廣泛的方式[5]。

McFall等[8]將Y-79和WERI-RB細(xì)胞分別注入經(jīng)免疫抑制后的兔眼的前房中，成為最早成功構(gòu)建RB移植瘤模型的研究者之一。Chévez-Barrios等[9]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，不同于WERI-RB細(xì)胞，Y-79細(xì)胞更易經(jīng)視神經(jīng)向腦部轉(zhuǎn)移。目前普遍認(rèn)為，移植瘤模型RB細(xì)胞的生長部位取決于腫瘤細(xì)胞注射的部位。但Lemaitre等[4]發(fā)現(xiàn)，采取玻璃體腔注射后腫瘤生長更快，而即使將RB細(xì)胞注射于視網(wǎng)膜下間隙，RB細(xì)胞也易侵入玻璃體腔生長，因此他們認(rèn)為采取玻璃體腔注射可與視網(wǎng)膜下注射取得相似的RB動物模型。模型動物經(jīng)放射、胸腺切除或藥物處理致其免疫系統(tǒng)受損，使得移植瘤模型成功率上升[10]。而直接使用裸鼠和SCID小鼠不僅可免于對模型動物免疫系統(tǒng)的破壞，還能最大限度地保持RB細(xì)胞的組織學(xué)和生物完整性[11]。RB細(xì)胞注射后2周可見視網(wǎng)膜生長白色腫塊，注射后3～5周RB侵入玻璃體及前房，病理下可見大量RB細(xì)胞浸潤[5]。

異種植入移植瘤模型造模方式相對簡單，經(jīng)濟(jì)成本相對較低，是目前構(gòu)建RB動物模型使用最廣泛的方法。此外，該模型直接將人類RB細(xì)胞進(jìn)行移植，可重復(fù)性好，腫瘤組織學(xué)特性以及對藥物的反應(yīng)性更加接近人類RB患者[12-13]，因此成為可快速有效地篩選潛在藥物的模型。

2 轉(zhuǎn)基因的RB動物模型

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(retinoblastoma protein,pRB)是相對分子質(zhì)量為105 000的磷酸蛋白，屬于“囊袋蛋白”家族[14]。具有DNA病毒蛋白譜的pRB復(fù)合物又被稱為病毒癌蛋白(viral oncogene)，主要包括腺病毒5型癌蛋白、猿猴病毒40T抗原(simian virus 40 large T-antigen,SV40-Tag)、人乳頭瘤病毒(human papilloma virus,HPV)16型和18型的E7蛋白[15]。該類病毒可將自身DNA整合至宿主細(xì)胞的基因組從而轉(zhuǎn)化細(xì)胞，因此，常用于RB轉(zhuǎn)基因動物模型的構(gòu)建。將外源性DNA序列以非同源重組的方式與啟動子耦合后微注射至受精卵中，并將其轉(zhuǎn)移至假孕的雌鼠子宮內(nèi)，則一部分子代可攜帶和穩(wěn)定表達(dá)轉(zhuǎn)基因性狀，并將該性狀穩(wěn)定地向后代傳遞，由于轉(zhuǎn)基因RB小鼠具有較好的自發(fā)性，因此常作為模型動物。

在轉(zhuǎn)基因RB動物模型中，常以SV40-Tag作為啟動子標(biāo)記基因。Windle等[16]將SV40-Tag與黃體生成素β-T抗原(luteinizing hormone β-Tantigen,LHβ-Tag)共雜交，成功構(gòu)建了第一個(gè)RB轉(zhuǎn)基因小鼠模型。該研究發(fā)現(xiàn)被標(biāo)記基因在垂體前葉分泌的促性腺激素中持續(xù)表達(dá)，并在5個(gè)月后形成雙側(cè)性RB。SV40基因組在大T區(qū)和小T區(qū)具有癌基因表達(dá)，均通過與P53、pRB家族結(jié)合而引起組織的腫瘤發(fā)生。該腫瘤亦表現(xiàn)出內(nèi)生性和外生性，其不斷向玻璃體腔、視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜以及視神經(jīng)進(jìn)展[17]。此外，以視黃醛受體結(jié)合蛋白啟動子標(biāo)記的RB轉(zhuǎn)基因動物則多表現(xiàn)為神經(jīng)元特性，電鏡下觀察5月齡小鼠可見與人類RB常見的F-W薔薇花(Flexner-winterstainer)型和H-W薔薇花(Homer-Wright)型[18-19]。HPV E6可與P53結(jié)合從而抑制其功能，而HPV E7則與pRB、P107、P130結(jié)合而將其降解。運(yùn)用HPVE6和HPVE7的靶向結(jié)合構(gòu)建的動物模型為研究RB發(fā)生機(jī)制提供了獨(dú)特的方式[20]。

Tag轉(zhuǎn)基因模型已成為研究RB發(fā)生的重要工具。然而，病毒癌基因蛋白與其他組織蛋白的相互作用機(jī)制尚不清楚，因此其腫瘤發(fā)生的特異性低于移植瘤模型。

3 基因敲除(knockout，KO)RB模型

KO動物模型以小鼠多見，其通過同源重組技術(shù)，將外源基因與靶向基因載體相結(jié)合，而使靶向基因被替換或功能喪失，KO技術(shù)極大地推動了RB動物模型的發(fā)展。但早期RB KO小鼠多表現(xiàn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)腫瘤而非RB，視網(wǎng)膜則多表現(xiàn)為異位有絲分裂以及大量細(xì)胞變性[21]。當(dāng)時(shí)已有研究者認(rèn)識到P107可在RB1失活時(shí)發(fā)揮抑癌作用[22]。MacPherson等[23]發(fā)現(xiàn)新生乳鼠視網(wǎng)膜缺乏RB1時(shí)，P107表達(dá)持續(xù)上調(diào)。但同時(shí)缺乏RB1、P107及P53的小鼠并不會產(chǎn)生光感受器的惡變，通過構(gòu)建巢蛋白、Chx10、Pax6啟動子以選擇性敲除視網(wǎng)膜組蛋白，于3～9個(gè)月后，在視網(wǎng)膜出現(xiàn)肉眼可見的腫瘤團(tuán)塊。其中，巢蛋白-Cre KO小鼠可見雙側(cè)RB，且組織結(jié)構(gòu)和人類RB類似，并向眼外肌和視神經(jīng)侵犯[24]。

RB1/P107雙敲除(double knockout，DKO)小鼠的視網(wǎng)膜細(xì)胞出現(xiàn)大量凋亡表型，但仍有眾多水平細(xì)胞和無長突細(xì)胞存活，但并未檢測到RB細(xì)胞凋亡[25]。這與人類RB發(fā)生及其相似。在RB/P130 DKO模型中，出現(xiàn)腫瘤發(fā)生延遲和較低的外顯率。而P130在視網(wǎng)膜的發(fā)育、細(xì)胞周期調(diào)控與腫瘤抑制方面均發(fā)揮了重要作用[26]。RB1/P107和RB/P130 DKO RB模型均可見RB細(xì)胞沿視神經(jīng)侵犯腦部，這與人類RB的轉(zhuǎn)移方式具有相似性[27]。

RB KO動物模型腫瘤發(fā)生于人類RB患者相似，該模型使得人類RB的生物學(xué)特征在動物模型上得到很好的重現(xiàn)[28]。此外，RB KO模型可較好地模擬人類RB的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。與移植瘤模型相比，RB KO模型腫瘤生物力學(xué)、腫瘤微環(huán)境、腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移以及對腫瘤治療策略的篩選更為可靠[29]。

4 小結(jié)與展望

人類RB的發(fā)生不僅受到機(jī)體的調(diào)控，也與生活和工作環(huán)境、飲食習(xí)慣密切相關(guān)，盡管RB動物模型的構(gòu)建有不同方式，但均存在局限性。移植瘤模型動物多存在免疫抑制甚至免疫缺陷，腫瘤也并非原發(fā)性，移植部位也并非人類RB生長部位。而Tag轉(zhuǎn)基因模型操作較復(fù)雜、困難，造模預(yù)算較高且無法表現(xiàn)出人類RB的局灶性和克隆性。同移植瘤相比，RB KO模型的被敲除基因調(diào)控機(jī)制復(fù)雜且腫瘤特異性相對較低且模型動物存在一定的死亡率。

由于腫瘤的發(fā)生及其復(fù)雜，如何構(gòu)建特異性更高、腫瘤的生物學(xué)特征更接近人類RB的模型，仍需進(jìn)一步探索。但通過動物模型，可明確RB的組織超微結(jié)構(gòu)、生物學(xué)特征、信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)以及分子之間交互作用等。此外，通過對動物模型不斷深入研究，有望提高早期診斷與早期治療的水平，亦是改善患兒視功能與延長生存期的重要臨床前手段。通過RB動物模型尋找腫瘤發(fā)生初期具有高特異性的分子靶標(biāo)對于早期診斷有重要意義。