尖孢鐮刀菌效應(yīng)蛋白研究進(jìn)展

林羽立

(廈門市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，福建 廈門 361000)

尖孢鐮刀菌(Fusarium oxvsporum)是真菌類群，分類上隸屬于半知菌類(Xmperfeetifungi)、鐮刀菌屬(Fusarium)。尖孢鐮刀菌通過無性繁殖產(chǎn)生大量形似鐮刀的大型分生孢子寄生在作物體內(nèi)，并以土壤傳播形式廣泛存在于世界范圍內(nèi)。尖孢鐮刀菌主要從根部危害植物，引起維管束發(fā)生，破壞導(dǎo)管功能，造成植物枯死，可危害植物的整個生育期。尖孢鐮刀菌與農(nóng)業(yè)生產(chǎn)息息相關(guān)，可導(dǎo)致多種農(nóng)作物發(fā)生真菌性病害，如黃瓜、西瓜、哈密瓜、黃豆、辣椒、番茄、甘蔗、甘薯、大豆等，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來了嚴(yán)重的損失[1]。目前，尖孢鐮刀菌與農(nóng)作物的互作關(guān)系已經(jīng)成為國內(nèi)外的研究熱點，有助于明確病原菌的致病機(jī)理，以及為遺傳育種、突變體資源和基因組信息方面提供更多便利。而效應(yīng)蛋白是病原菌與植物互作過程中產(chǎn)生的分泌物，其與尖孢鐮刀菌的致病性和寄主的抗病性有著密切關(guān)系。因此，病原菌效應(yīng)蛋白的研究是了解尖孢鐮刀菌和農(nóng)作物互作關(guān)系的重要研究方向。近年來，針對尖孢鐮刀菌效應(yīng)蛋白的預(yù)測、功能鑒定及其作用機(jī)制等方面的研究已取得一定的成果。本文綜述了尖孢鐮刀菌效應(yīng)蛋白的研究現(xiàn)狀，包括分泌蛋白組、致病蛋白、無毒蛋白等方面，并對未來的研究方向做出探討。

1956年，F(xiàn)lor在亞麻和亞麻銹菌的小種特異抗性的研究基礎(chǔ)上提出“基因?qū)颉笨共⌒詫W(xué)說，該學(xué)說認(rèn)為，當(dāng)攜帶無毒基因(avirulence gene,Avr基因)的病原體侵染攜帶抗病基因(resistance gene,R基因)的寄主時，寄主會表現(xiàn)抗病。農(nóng)作物與鐮刀菌的互作關(guān)系符合這一學(xué)說[2]。隨著植物分子病理學(xué)的發(fā)展，2006年Jones認(rèn)為當(dāng)病原菌侵染作物時，作物表面啟動PAMPs(pathogen-associated molecular patterns)分子機(jī)制識別病原菌，由此激發(fā)作物的PTI(PAMP-triggered immunity)免疫反應(yīng)，而病原菌會分泌一些蛋白到寄主細(xì)胞中抑制植物的免疫反應(yīng)，此類蛋白被稱為效應(yīng)蛋白，此時寄主細(xì)胞內(nèi)的R基因所編碼的R蛋白會對病原菌的效應(yīng)蛋白進(jìn)行特異性識別，繼而激發(fā)ETI(effector-triggered immunity)免疫反應(yīng)，這是作物“基因?qū)蚩剐浴碧禺愋苑烙到y(tǒng)，僅發(fā)生在特定寄主基因型與病原小種之間[3]。經(jīng)過寄主和病原菌協(xié)同進(jìn)化，新的效應(yīng)蛋白和抗性蛋白不斷產(chǎn)生。

1 鐮刀菌分泌蛋白組

只有當(dāng)病原效應(yīng)蛋白到達(dá)作物寄主細(xì)胞的特定空間時，病原菌的功能才能發(fā)揮。真菌病原菌的效應(yīng)蛋白因子在細(xì)胞內(nèi)合成后，由信號肽引導(dǎo)通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體-質(zhì)膜的分泌途徑分泌到胞外[4]。真菌分泌蛋白的的信號肽位于蛋白序列的N-末端，約由15～60個疏水氨基酸殘基組成。分泌蛋白包括細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、生長因子和細(xì)胞因子等，占基因組編碼的所有蛋白質(zhì)中的10%～15%[5]。

近年來，植物真菌全基因組序列的解析為植物病原的分泌蛋白組提供了重要的研究基礎(chǔ)。禾谷類鐮刀菌(F.graminearum)是第1個完成全基因組測序的鐮刀菌[6]，2005年DOE JGI啟動了腐皮孢鐮刀菌(F.solani)基因組測序計劃，2008年Broad研究所完成擬輪枝鐮刀菌(F.verticillioides)和尖孢鐮刀菌(F.oxysPorum)基因組測序。2007年Cuomo c A等利用近親緣雜交技術(shù)分析了禾谷鐮刀菌侵染植物過程中的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)，結(jié)果在高密度SNPs區(qū)域中檢測到382個高效特異表達(dá)的基因，其中包括分泌蛋白和毒力因子，分泌蛋白的N端具有一段引導(dǎo)多肽進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的疏水信號肽，該信號肽在基因序列上具有相應(yīng)的編碼，因此可以通過序列比對和信號肽預(yù)測來尋找分泌蛋白[7]。2007年P(guān)aper等以禾谷鐮刀菌為研究對象，對體外培養(yǎng)和感染小麥時的分泌蛋白組進(jìn)行分析，推測信號肽在禾谷鐮刀菌與宿主作物相互作用中發(fā)揮了重要作用[8]。于欽亮等基于生物信息學(xué)的方法對禾谷鐮刀菌全基因組進(jìn)行信號肽分析，預(yù)測出606個潛在的分泌蛋白編碼基因，繼而在潛在分泌蛋白中發(fā)現(xiàn)157個分泌蛋白帶有保守的RXLX模體，其中有79個分泌蛋白具有可預(yù)測的功能性描述，形成了該物種的激發(fā)子蛋白集[9]。2010年Ma L J等以鐮刀菌屬中3個不同寄主范圍的生理小種為研究對象，對其分泌蛋白組進(jìn)行差異比較，發(fā)現(xiàn)了強(qiáng)毒菌株特有的4條LS染色體可將弱毒株轉(zhuǎn)化為強(qiáng)毒株，LS染色體中含有大量的激發(fā)子類和細(xì)胞壁降解酶類分泌蛋白基因，從而證明分泌蛋白類群在鐮刀菌生物學(xué)毒性中起重要作用[10]。2012年Brown等在禾谷鐮刀菌上確定了2007個決定植物致病和毒性的外分泌蛋白[11]。鐮刀菌的分子生物學(xué)研究起步較晚，目前僅局限于對單個致病基因功能的研究水平，而部分鐮刀菌菌種基因組測序的完成會為基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)全面分析菌種致病性、效應(yīng)因子等相關(guān)研究帶來契機(jī)。

2 影響致病性的鐮刀菌分泌蛋白

鐮刀菌在孢子萌發(fā)后形成菌絲體，可侵染作物根尖或新鮮傷口組織，在寄主體內(nèi)繁殖并產(chǎn)生大量的致病性相關(guān)分泌物。尖孢鐮刀菌番茄專化型(F.oxysporum f.sp.lycopersici,Fol)是一種胞外病原菌，在侵染番茄木質(zhì)部時會產(chǎn)生分泌蛋白在木質(zhì)部的汁液中，即Six蛋白(Secreted In Xylem)[12]?，F(xiàn)已在Fol中發(fā)現(xiàn)了14種Six基因，即Six1～Six14[13-15]。最初，研究者認(rèn)為Six基因僅存在于Fol中，如今也發(fā)現(xiàn)存在于其它尖孢鐮刀菌?；椭衃16]。目前，Six蛋白的致病性研究已經(jīng)取得了很大進(jìn)展。尖孢鐮刀菌可侵染100多種植物，但每個?；椭荒芮秩疽环N或少數(shù)幾種作物，寄主范圍窄，特異性強(qiáng)，這與Six蛋白的功能密切相關(guān)。

研究表明，Six基因與病菌的致病力密切相關(guān)。Fov侵染寄主時，Six基因可作為分子標(biāo)記來識別病原菌的存在。以Six6為例，通過PCR分子標(biāo)記技術(shù)，可以將具有致病性的Fov菌種與其它非致病性的菌種區(qū)分開來，即含有Six6的菌種為Fov[17]。同時，Six6是致病因子，其能夠增加鐮刀菌的致病性[18]。所有Six6均具有8個保守的半胱氨酸殘基，其中1個位于信號肽中，且不同生理小種的Six6蛋白存在若干氨基酸的差異，這些差異會造成Six6氨基酸涉及到的致病因子功能的不同[19]。此外，鐮刀菌分泌的Six6蛋白還能激發(fā)寄主植物的抗性機(jī)制，2012年牛曉偉從Fon中克隆了Six6基因，通過構(gòu)建該基因的酵母誘餌表達(dá)載體并采用酵母雙雜交技術(shù)，明確了FonSIX6主要作用的靶位點可能主要是植物能量系統(tǒng)和光合作用，而植物識別后對其響應(yīng)的方式是調(diào)控抗病基因的表達(dá)，為西瓜的抗病機(jī)制提供了線索[20]。鐮刀菌中Six6基因的存在雖然對植物生長發(fā)育有著重要影響，卻不影響真菌自身的生長。2013年唐安寧在克隆了Fon的Six6基因后，利用基因敲除技術(shù)構(gòu)建了FonSIX6基因缺失突變體，觀察后發(fā)現(xiàn)，該基因的缺失并不影響真菌的生長情況。這主要原因可能是FonSIX6蛋白含有16個氨基酸的信號肽，屬于分泌型蛋白，并不參與生理小種的生長過程[21]。

3 誘導(dǎo)植物細(xì)胞壞死的鐮刀菌效應(yīng)蛋白

一些植物病原菌在侵染寄主的過程中分泌的蛋白質(zhì)可誘導(dǎo)植物細(xì)胞的死亡，即效應(yīng)蛋白可作為毒性因子來發(fā)揮作用。

NIP蛋白(necrosis inducing protein)是一種細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)蛋白，可誘導(dǎo)植物細(xì)胞死亡，引發(fā)植物抗性相關(guān)基因的表達(dá)。2011年據(jù)Feng報道，在植物病原真菌中存在NIP蛋白家族[22]，不同的NIP基因可能在不同的時期表達(dá)，執(zhí)行不同的功能。2012年Kirsten發(fā)現(xiàn)，大麥云紋菌中NIP1基因在孢子世代就已表達(dá)，其與孢子生長有關(guān)，而NIP2和NIP3僅在侵染過程中表達(dá)，與致病過程密切相關(guān)[23]。但在不同寄主植物中，NIP蛋白的致病性可能存在著差異，2013年Santhanam發(fā)現(xiàn)，維管枯萎病原菌中存在2個可誘導(dǎo)作物細(xì)胞死亡的NIP蛋白，但對擬南芥、煙草和番茄無致死功能[24]。2014年Feng發(fā)現(xiàn)，辣椒疫霉菌中存在3個NIP基因存在很強(qiáng)的致病性，并且在辣椒中誘導(dǎo)葉片失綠和細(xì)胞凋亡的效果比在煙草中強(qiáng)烈[25]。

有些NIP蛋白中還可誘導(dǎo)植物產(chǎn)生乙烯并致其死亡，即為NLP蛋白(NEP1-like proteins)，其具有半保守結(jié)構(gòu)域和N-末端分泌信號肽的蛋白質(zhì)，是一類新型的誘導(dǎo)壞死效應(yīng)蛋白。1995年Bailey等從尖孢鐮刀菌培養(yǎng)液中分離出NLP蛋白(NEP1-like proteins)，可誘導(dǎo)作物產(chǎn)生乙烯并致其死亡，是一類新型誘導(dǎo)作物壞死的效應(yīng)蛋白[26]，隨后研究者發(fā)現(xiàn)，這類蛋白質(zhì)廣泛存在于農(nóng)作物病原細(xì)菌、真菌、卵菌以及一些非病原微生物中，其中以卵菌居多，如腐霉菌、疫霉菌、大豆疫霉菌以及細(xì)菌軟腐病菌等[27]。NLP蛋白既能激發(fā)植物的抗病反應(yīng)，又能誘導(dǎo)植物細(xì)胞死亡，目前已證實20多種雙子葉植物中的NLP蛋白有上述作用[28]?；贜LPs蛋白的研究表明，誘導(dǎo)植物細(xì)胞壞死的蛋白對病原菌的致病力和毒性有著重要的影響，因為其在病原侵染寄主的過程中存在著高表達(dá)。2006年Kanneganti等在致病疫霉3個NLP基因中發(fā)現(xiàn)PiNPP1.1基因具有很強(qiáng)的誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的活性[29]。Qutob和Kanneganti的研究表明，在大豆疫霉病和馬鈴薯晚疫病中，NPP1和PiNPP1.1在后期的腐生階段及侵染過程中呈上調(diào)表達(dá)，由此推測NLPs通過溶解細(xì)胞實現(xiàn)病原菌的致病性[29]。2009年Ottmann等驗證了這一推測，通過解析NLPs的晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)NLPs具有細(xì)胞溶解毒素功能，病原菌通過分泌這一毒素，破壞寄主細(xì)胞膜完整性并促使植物細(xì)胞產(chǎn)生壞死[30]。但并不是所有NLP蛋白都具有細(xì)胞溶解活性，且致病效果也不盡相同。2013年P(guān)arthasarathy等論證了NLP蛋白家族的功能多樣性，在NLP1～NLP7和NLP9中，只有NLP1和NLP2對番茄有毒性作用，可影響植物的營養(yǎng)生長和孢子的萌發(fā)，其余的NLP蛋白對番茄不具有致病性[31]。因此，NLP蛋白在不同病原菌和植物寄主之間發(fā)揮著不同的作用。

4 鐮刀菌Avr蛋白

根據(jù)Flor提出的“基因?qū)颉笨共⌒詫W(xué)說，只有當(dāng)病原攜帶Avr基因且寄主攜帶R基因時，二者互作才表現(xiàn)出不親和，即寄主表現(xiàn)抗病[2]。農(nóng)作物與鐮刀菌的相互作用符合這一學(xué)說，并已經(jīng)成為植物病理學(xué)的研究熱點。目前，雖然只在少數(shù)真菌中成功克隆到無毒基因，但相關(guān)研究也取得了一定進(jìn)展。

尖孢鐮刀菌的Six蛋白在其與番茄的互作中起著重要作用，其中Six1、Six3、Six4已被鑒定為無毒蛋白，分別命名為Avr3、Avr2、Avr1[13]。Avr3是一種小分子量富含半胱氨酸蛋白，屬于非原質(zhì)體蛋白，大小約32kDa，在番茄抗病蛋白I-3、I-2和I介導(dǎo)的抗病過程起重要作用[18]。Fol侵入番茄之后，在木質(zhì)部中分泌Avr3蛋白，誘導(dǎo)番茄寄主的I-3抗性基因的大量表達(dá)，從而啟動防御機(jī)制，可提高番茄的抗病。當(dāng)Fol缺失Avr3時，病原菌可能將對番茄產(chǎn)生致病性。因此，F(xiàn)ol中的Avr3可作為無毒因子觸發(fā)番茄抗性，其的缺失很可能會導(dǎo)致番茄病變[32]。編碼Avr3的基因位于Fol基因組的一條非必要小染色體上，這條染色體含有許多轉(zhuǎn)座因子和類似致病島的區(qū)域，在其它真菌病原真菌中也有相同描述，如交鏈孢屬、叢赤殼屬等。

Six4蛋白由無毒基因Avr1編碼，是1個小分子量富胱氨酸分泌蛋白，與Avr3、Six和Avr2不在同一條染色體上，攜帶Avr1的Fol菌株可以誘導(dǎo)番茄產(chǎn)生I或I-1基因介導(dǎo)抗病過程。然而，不同于Fol中的Avr3和Avr2，Avr1在不具有特異R基因的番茄生理小種中是不致病的，即Avr1是無毒因子。并且，F(xiàn)ol的Avr1會抑制番茄的I-2和I-3基因所誘導(dǎo)的抗性反應(yīng)，但是這種抑制功能的潛在分子機(jī)制還未定論[33]。農(nóng)作物是否具有相應(yīng)R基因決定其對某種病原物的特異抗性，同時，病原物是否具有Avr基因決定其的專一致病性[34]。因此，Avr基因是理想的分子標(biāo)記候選，其可以通過自身的專一致病性將菌種區(qū)分開[34]。據(jù)Lievens等和Van der Does等的報道，在Fol的生理小種Ⅰ中有Avr1基因，而生理小種Ⅱ和生理小種Ⅲ中找不到Avr1基因，因此，Avr1基因可區(qū)別生理小種Ⅰ和生理小種Ⅱ、Ⅲ。另外，可利用Avr2基因?qū)⑸硇》NⅡ、Ⅲ與其它菌種區(qū)分[33]。

5 展望

效應(yīng)蛋白在植物與尖孢鐮刀菌互作過程中起著關(guān)鍵作用，其既關(guān)系著植物病原菌能否成功侵染寄主，也是植物免疫系統(tǒng)識別病原菌的靶標(biāo)。明確效應(yīng)蛋白的功能及其作用機(jī)制是植物病理學(xué)的研究重點，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)有著深遠(yuǎn)意義。

目前，植物與尖孢鐮刀菌的互作機(jī)制研究已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，如部分尖孢鐮刀菌基因組測序的完成、致病或致死相關(guān)基因的分離與功能鑒定、無毒蛋白的發(fā)現(xiàn)和功能鑒定等。但此研究仍然處于起步階段，甚至相較于其它病原真菌的研究仍顯滯后，尖孢鐮刀菌的基因組測序工程僅局限于若干生理小種，導(dǎo)致仍有許多生理小種的效應(yīng)蛋白研究仍是空白；已完成基因組測序的鐮刀菌中存在的編碼分泌蛋白數(shù)量仍在預(yù)測階段，絕大多數(shù)基因功能屬于未知階段；鐮刀菌效應(yīng)蛋白致病性的分子機(jī)制仍未見報道；鐮刀菌效應(yīng)蛋白作用與寄主細(xì)胞的靶標(biāo)及功能機(jī)制還有待闡明等。因此，將分泌組學(xué)、比較基因組學(xué)和比較蛋白質(zhì)組學(xué)相結(jié)合來鑒定效應(yīng)蛋白是研究農(nóng)作物與尖孢鐮刀菌互作機(jī)制的主要研究方向。