含纈酪肽蛋白在腫瘤中的研究進(jìn)展*

郭小菲，艾浩

1.天津市濱海新區(qū)塘沽婦產(chǎn)醫(yī)院，天津 300450；

2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院，遼寧錦州 121001

含纈酪肽蛋白（VCP）又名p97，在酵母中叫CDC48，在果蠅中叫TER94［1］。近年來發(fā)現(xiàn)，其高表達(dá)與許多腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。本文就其在腫瘤中的研究進(jìn)展做介紹。

1 VCP的結(jié)構(gòu)

在第9p13-p12染色體上存在著一個(gè)可以編碼可溶性蛋白的基因，它就是VCP，其分子量是97kDa。VCP最主要分布的地方是細(xì)胞的胞質(zhì)中，其次有一部分存在于亞細(xì)胞器（高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體）的細(xì)胞膜上，也有一小部分定位在細(xì)胞核，協(xié)助核染色質(zhì)降解相關(guān)過程和核蛋白質(zhì)量控制。VCP屬于參與多種細(xì)胞活動(dòng)的ATP酶家族中（AAA+）的一員，這一家族中所有成員的作用都是作為分子伴侶促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊或展開［2］，利用ATP水解能組裝成由兩個(gè)同心環(huán)構(gòu)成的一個(gè)穩(wěn)定六聚體環(huán)，并且它的組裝不依賴于核苷酸的存在，這一點(diǎn)不同于細(xì)菌的AAA+蛋白。其AAA組件是由一個(gè)螺旋形結(jié)構(gòu)域和一個(gè)高度保守的RecA樣的結(jié)構(gòu)域組成，這一結(jié)構(gòu)同其他的AAA+ATP酶結(jié)構(gòu)相似。RecA樣結(jié)構(gòu)域的特征是在兩個(gè)相鄰子單元的接口處有一個(gè)核苷酸綁定位點(diǎn)，在這個(gè)結(jié)構(gòu)中，精氨酸-指殘留物通過參與ATP r-磷酸化能促進(jìn)核苷酸水解。此外，活化位點(diǎn)還包含經(jīng)典的WalkerA核苷酸結(jié)合位點(diǎn)和WalkerB核苷酸水解位點(diǎn)，二者的主要任務(wù)就是負(fù)責(zé)核苷酸的結(jié)合和水解。VCP主要由四個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成：氨基端泛素結(jié)合域、兩個(gè)ATP酶結(jié)構(gòu)域和一個(gè)羧基端區(qū)域［3］。因其同時(shí)擁有兩個(gè)AAA+ATP酶結(jié)構(gòu)域（分別命名為D1結(jié)構(gòu)域和D2結(jié)構(gòu)域），故又稱其為Ⅱ型AAA+ATP酶。兩個(gè)ATP酶結(jié)構(gòu)域（D1和D2）由一個(gè)短多肽鏈接器連接，D1結(jié)構(gòu)域與氨基端結(jié)構(gòu)域（主要識(shí)別底物和銜接分子）由另外一個(gè)鏈接器連接，D2結(jié)構(gòu)域的羧基末端是一個(gè)含有40個(gè)氨基酸殘基的短尾［4］。D1和D2結(jié)構(gòu)域的共同特征是ATP水解不同步，這一特征和VCP的氨基端結(jié)構(gòu)域與某些輔助因子和適配器的不對(duì)稱結(jié)合有關(guān)。與VCP相互作用的蛋白質(zhì)主要分為兩類，一類是適配器，其主要功能是把VCP和特定的亞細(xì)胞器或底物連接在一起；另一類是輔助因子，因其通常具有酶活性，所以其主要功能是幫助VCP處理底物。盡管有一些蛋白質(zhì)是通過羧基端尾與VCP結(jié)合，如PLAA/Ufd3、HOIP、PNGase和Ufd2［5-6］，但其發(fā)揮分子伴侶的作用主要是通過與其氨基端結(jié)構(gòu)域結(jié)合，如Ufd1、p47、ataxin3和UBX等，其中UBX域是一個(gè)與泛素相關(guān)的80余個(gè)模塊結(jié)構(gòu)，存在于一個(gè)p97適配器家族中，被稱為UBX蛋白質(zhì)，由13個(gè)成員組成。VCP的功能與其輔助因子和適配器能夠識(shí)別泛素偶聯(lián)物有關(guān)，而其功能關(guān)鍵所在是整個(gè)VCP系統(tǒng)與泛素之間的相互作用。盡管在序列和結(jié)構(gòu)上，D1和D2結(jié)構(gòu)域是同源的，但二者的功能卻不相同。例如：D1結(jié)構(gòu)域參與VCP的六聚體組裝，而D2結(jié)構(gòu)域主要負(fù)責(zé)整個(gè)ATP酶的活性［7］。

2 VCP的功能

2.1 蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)控制

（1）內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解：VCP在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解通路中起到重要作用，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解主要是清除在分泌途徑中錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)，是一種進(jìn)化了的高度保守的生物過程。錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中會(huì)被運(yùn)回到細(xì)胞質(zhì)，然后在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)再通過一系列的蛋白酶依賴的降解途徑降解掉。在這一降解過程中，VCP起到重要作用，其將位于細(xì)胞質(zhì)中的錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)糖基化或者泛素化，然后再通過26S蛋白酶體（一種蛋白水解復(fù)合物，可以降解泛素修飾過的蛋白質(zhì)）降解，并能將泛素收回后再利用。目前，關(guān)于VCP在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解中的調(diào)控模式尚未完全了解，有待進(jìn)一步研究。（2）線粒體相關(guān)降解：Heo等［8］已經(jīng)證明，VCP通過從線粒體外膜攝取多肽來促進(jìn)線粒體相關(guān)降解，這一過程消除了線粒體外膜的異常多肽，維持了線粒體蛋白質(zhì)的穩(wěn)態(tài)。此外，線粒體自噬的調(diào)控者（如線粒體融合蛋白）在轉(zhuǎn)移到受損的線粒體時(shí)也可能被線粒體相關(guān)降解途徑所破壞。當(dāng)線粒體受損時(shí)，VCP和它的輔助因子（Ufd1，Npl4）會(huì)被招募到線粒體表面，這一過程是線粒體自噬清除受損線粒體時(shí)必不可少的［9］，即VCP及它的輔助因子受損時(shí)，會(huì)影響線粒體自噬清除受損線粒體這一過程。雖然目前已經(jīng)知道VCP在線粒體調(diào)解過程中起到關(guān)鍵作用，但對(duì)于線粒體自噬或線粒體相關(guān)降解過程中招募VCP到線粒體表面的具體機(jī)制尚不清楚。Heo等［10］發(fā)現(xiàn)了一種叫VCP相關(guān)線粒體應(yīng)激反應(yīng)1（Vms1）的蛋白作為潛在的鏈接器，但其在線粒體相關(guān)降解中的作用仍存在異議。（3）核糖體相關(guān)降解：VCP參與停滯在核糖體上的異常新生多肽的降解過程，這一過程被稱為核糖體相關(guān)降解（RAD）。當(dāng)mRNA在翻譯過程中有缺陷時(shí)（如終止密碼子的缺失等），就會(huì)發(fā)生核糖體停滯。這種存在缺陷的mRNA會(huì)在翻譯測(cè)試其保真度后被迅速分解［11］。因此，這個(gè)過程不可避免地與異常多肽的產(chǎn)生相關(guān)，而這些異常的多肽需要被有效清除，在這一過程中核糖體相關(guān)因子Rqc1會(huì)與VCP的泛素化底物結(jié)合，進(jìn)而從核糖體中提取出有缺陷的多肽并將異常多肽轉(zhuǎn)運(yùn)到蛋白酶體進(jìn)行降解。相反，當(dāng)VCP與它的輔因子Ufd1和Npl4失活時(shí)就會(huì)導(dǎo)致60S核糖體復(fù)合物中的泛素蛋白的積累［12］。（4）染色質(zhì)相關(guān)降解：VCP通過類似于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解的方式從核染色質(zhì)釋放多肽，并在這一系列過程中與底物相互作用而發(fā)揮其功能，這一過程被稱為染色質(zhì)相關(guān)降解過程。目前已經(jīng)確定的與VCP相互作用的底物有轉(zhuǎn)錄抑制因子a2、RNA聚合酶Ⅱ復(fù)合體、DNA復(fù)制許可因子CDT1、CMG DNA解螺旋酶、復(fù)制體組件Mcm7、DNA修復(fù)蛋白DDB2/XPC、Rad52和RNA結(jié)合蛋白［13］等，這些底物將VCP和各種核途徑聯(lián)系到一起，包括從基因轉(zhuǎn)錄到DNA復(fù)制與修復(fù)。

2.2 自噬

自噬屬于一種應(yīng)激適應(yīng)過程，現(xiàn)有證據(jù)表明VCP參與了自噬過程。Krick等［14］在酵母菌中發(fā)現(xiàn)CdC48的適配器Shp1p與Atg8p（一個(gè)重要的自噬調(diào)控因子）相互作用，而Cdc48p和Shp1p的復(fù)合物也參與了大自噬。VCP也被證明在清除應(yīng)激顆粒中積累的非翻譯信使核糖核蛋白復(fù)合物中發(fā)揮至關(guān)重要的作用［15］。VCP同樣也參與了細(xì)胞質(zhì)聚集物的降解，其降解過程主要是通過聚集物自噬依賴途徑降解。聚集物通過E3泛素連接酶形成多泛素化蛋白然后與HDAC6（一種動(dòng)力蛋白復(fù)合物）形成聚合物并招募p62-NBR1-ALFY復(fù)合物形成自噬體和自噬溶酶體。研究已經(jīng)證實(shí)VCP與HDAC6發(fā)生相互作用，VCP缺失或HDAC6缺失都會(huì)造成自噬溶酶體融合的缺陷。VCP失活時(shí)會(huì)導(dǎo)致自噬體的大量積累，而這些自噬體不能成熟為自噬細(xì)胞［16］。

2.3 膜融合

目前已知，VCP具有介導(dǎo)膜融合的作用，而且在減數(shù)分裂期高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及核膜的重新組裝的過程中也需要VCP的參與。VCP在介導(dǎo)膜融合過程中，p47作為第一個(gè)發(fā)現(xiàn)的重要的輔助因子。它通過VCP與Syntaxin5連接。三聚體p47適配器在膜融合過程中起重要作用，在體外功能分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，在有絲分裂的高爾基片段中重新組裝高爾基體時(shí)加入p97/p47復(fù)合物是必需的，但是單加入p97是不夠的。有研究已經(jīng)證實(shí)［17］，p47參與了有絲分裂末期高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的重組，p47的羧基端有兩個(gè)VCP結(jié)合位點(diǎn)，其中一個(gè)就是UBX結(jié)構(gòu)域。它的氨基端有一個(gè)UBA結(jié)構(gòu)域與單泛素結(jié)合，對(duì)于高爾基體的重組很重要。另一個(gè)重要的輔助因子是VCIP135，被認(rèn)為是p97/p47/syntaxin5-相互作用蛋白，它有一個(gè)UBX結(jié)構(gòu)域，通過這個(gè)結(jié)構(gòu)域可以與VCP結(jié)合，它也可以與VCP/p47/syntaxin5復(fù)合物結(jié)合并通過VCP催化的ATP水解反應(yīng)。此外VCIP135也是體內(nèi)高爾基體組裝和ER交聯(lián)形成所必需VCIP135，還具有去泛素化活性，是體外高爾基體重組所必須［18］。Syntaxin5（Syn5）是p97/p47介導(dǎo)的高爾基體重組的受體蛋白，p47介導(dǎo)p97與Syn5結(jié)合。在有絲分裂過程中NSF介導(dǎo)的高爾基體重組也有Syn5的參與，過渡期內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的融合也需要Syn5的參與。

2.4 調(diào)控細(xì)胞周期

p97/p47通路參與細(xì)胞周期的調(diào)控，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂時(shí)，核膜破裂，p47進(jìn)入胞質(zhì)，同時(shí)CDC2激酶被有絲分裂激活后磷酸化。磷酸化的p47從高爾基體的細(xì)胞膜分離出來，導(dǎo)致p97/p47介導(dǎo)的膜融合受到抑制，最終高爾基膜破碎。在有絲分裂后期，去磷酸化的p47結(jié)合高爾基膜，使p97/p47介導(dǎo)的膜融合將高爾基體碎片重新組裝。而當(dāng)子細(xì)胞形成核膜時(shí)，p47移向細(xì)胞核導(dǎo)致p97/p47通路受抑制。對(duì)于p47的泛素化和去泛素化的調(diào)控是在其氨基端的UBA域，Catharina等［19］研究發(fā)現(xiàn)，VCP在人類U937白血病細(xì)胞周期的G0/G1發(fā)生阻滯，與蛋白和mRNA含量顯著增加有關(guān)。

3 VCP與神經(jīng)系統(tǒng)疾病

包涵體肌病、Paget疾病和額顳葉癡呆（IBMPFD）疾病是一種常染色體顯性遺傳性疾病，它會(huì)影響人的肌肉、大腦和骨骼。研究表明，其發(fā)生是由于VCP基因突變。到目前為止，在IBMPFD患者中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在VCP基因的29個(gè)不同位置有40多個(gè)突變，其中R155H突變是IBMPFD患者中最常見的突變，而A232E突變與最嚴(yán)重的臨床表現(xiàn)密切相關(guān)。VCP突變會(huì)影響其在很多方面的功能，如許多突變會(huì)減弱D1結(jié)構(gòu)域?qū)TP的親和力，導(dǎo)致D2結(jié)構(gòu)域ATP酶活性增加2～4倍［20］。突變后的VCP主要影響組織和器官，如肌肉和大腦的能量攝取。在細(xì)胞內(nèi)，線粒體通過氧化磷酸化產(chǎn)生ATP并向組織提供能量。結(jié)構(gòu)學(xué)研究表明，IBMPFD突變大多被映射到VCP N結(jié)構(gòu)域和D1結(jié)構(gòu)域之間的接口處。有研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，從IBMPFD個(gè)體提取出的細(xì)胞線粒體不能正常產(chǎn)生能量。Zhang等［21］通過對(duì)VCP突變的果蠅進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，其表現(xiàn)出IBMPFD癥狀（例如肌肉細(xì)胞的死亡），還發(fā)現(xiàn)肌肉細(xì)胞中的線粒體比正常細(xì)胞小很多，呈碎片狀。而線粒體融合蛋白控制著線粒體的融合。正常情況下，VCP能降解線粒體融合蛋白，突變的VCP會(huì)使線粒體融合蛋白過度降解，導(dǎo)致線粒體融合程度降低，最后導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙和死亡。線粒體功能障礙對(duì)IBMPFD的發(fā)病機(jī)制非常重要，但VCP突變改變線粒體功能的機(jī)制尚不清楚。

4 VCP與腫瘤的關(guān)系

Shinji等先后對(duì)156例食管鱗狀細(xì)胞癌［22］、75例濾泡性甲狀腺癌［23］、330例胃癌［24]、32例胰腺導(dǎo)管腺癌［25］和74例牙齦鱗癌［26］進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，VCP在腫瘤中陽性表達(dá)明顯高于正常組織，且其表達(dá)情況與轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)明顯相關(guān)，可以判斷患者的預(yù)后。劉廣鵬等［27］對(duì)60例普通型骨肉瘤進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在骨肉瘤中VCP呈高表達(dá)且與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在此基礎(chǔ)上，龍新華等［28］利用基因沉默技術(shù)研究VCP基因在骨肉瘤細(xì)胞系U2OS的增殖和遷移情況，研究結(jié)果顯示，沉默VCP基因時(shí)抑制U2OS細(xì)胞在體外增殖和遷移。隨后發(fā)現(xiàn)miRNA-129-5p靶向調(diào)控VCP的表達(dá)而抑制骨肉瘤細(xì)胞遷徙和侵襲能力。研究發(fā)現(xiàn)［29］VCP促進(jìn)結(jié)直腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，基因敲除VCP時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期停滯在G1期并通過STAT3途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Meyer等［30］對(duì)106名口腔鱗癌患者進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，HPV陰性的口腔鱗癌VCP表達(dá)明顯增高并可作為HPV陰性O(shè)SCC的預(yù)后標(biāo)志物。Valle等［31］對(duì)非小細(xì)胞肺癌組織和細(xì)胞系進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)VCP在非小細(xì)胞肺癌組織和細(xì)胞系呈高表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)抑制VCP不但可以有效抑制肺癌細(xì)胞的遷移和增殖，而且還能誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期。Peng等［32］對(duì)663例晚期以鉑為基礎(chǔ)化療的非小細(xì)胞肺癌患者VCP多態(tài)性與臨床結(jié)果相關(guān)性進(jìn)行分析，并對(duì)VCP的三種核苷酸多態(tài)性（SNPs）進(jìn)行了基因分型，結(jié)果顯示，SNP rs2074549與嚴(yán)重的嗜中性粒細(xì)胞減少癥顯著相關(guān)，其G/G基因型與野生型純合子A/A相比增加了3級(jí)或4級(jí)中性粒細(xì)胞減少的風(fēng)險(xiǎn)，首次證明了VCP多態(tài)性與晚期非小細(xì)胞肺癌以鉑類為基礎(chǔ)的化療的嚴(yán)重副反應(yīng)有相關(guān)性。游燊等［33］發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞癌患者VCP呈高表達(dá)并與pTNM分期、靜脈侵犯密切相關(guān)，對(duì)43例根治性肝癌切除的患者進(jìn)行隨訪時(shí)發(fā)現(xiàn)VCP高表達(dá)者2年復(fù)發(fā)率明顯高于VCP低表達(dá)者。Yu等［34］通過研究發(fā)現(xiàn)miR-129-5p抑制VCP的表達(dá)并通過VCP降解IκB-α參與NF-κB信號(hào)通路來調(diào)控肝癌細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移。聶鴻平等［35］發(fā)現(xiàn)VCP的表達(dá)與胃癌的浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)且表達(dá)風(fēng)度與腫瘤的分化程度、癌組織的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個(gè)數(shù)及病理TNM分期具有相關(guān)性，其表達(dá)是胃癌重要、獨(dú)立的預(yù)后因子。Mohammed等［36］發(fā)現(xiàn)，VCP在CIN2/CIN3+的敏感性達(dá)到93%、特異性達(dá)到88%，未來有可能可作為宮頸癌篩查的重要生物標(biāo)志物。

5 VCP的抑制劑

目前為止，共研制出幾種VCP的抑制劑：（1）內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解抑制劑Eeyarestatin I，它直接聯(lián)系內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和VCP，它可以抑制VCP相關(guān)的去泛素化酶和VCP依賴性蛋白質(zhì)降解，但不抑制VCP的ATP酶活性。（2）2-苯胺基-4-芳基-1、3-噻唑類化合物，它抑制VCP的ATP酶活性和VCP相關(guān)蛋白降解。（3）Syk抑制劑III通過在VCP的D2 ATP酶結(jié)構(gòu)域與Cys522和泛素融合蛋白相互作用，不可逆地抑制VCP的ATP酶活性。（4）N2，n4-二芐基喹啉-2，4-二胺（DBeQ），它是通過篩選化合物庫被鑒定出來的一種化學(xué)藥劑，作用于VCP的D1和D2-ATP酶結(jié)構(gòu)域，其特點(diǎn)是選擇性強(qiáng)、高效且可逆。它可以抑制ERAD和自噬，并可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。（5）KUSs，其特點(diǎn)是作為“VCP的調(diào)節(jié)器”“ATP的監(jiān)管者”不抑制細(xì)胞VCP功能的VCP。（6）CB-5083，具有口服生物可利用活性。作為第一個(gè)用于癌癥治療的VCP抑制劑正在臨床試驗(yàn)。（7）是ML240由DBeQ衍生而來，作用于D2 ATP酶結(jié)構(gòu)域。（8）NMS-873，其特點(diǎn)是強(qiáng)效、非共價(jià)、非ATP競(jìng)爭(zhēng)及變構(gòu)抑制劑，激活未折疊蛋白反應(yīng)，抑制自噬并誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。

綜上所述，VCP在蛋白質(zhì)質(zhì)量控制、自噬、膜融合和細(xì)胞周期的調(diào)控等方面發(fā)揮重要作用。目前，較為肯定的是VCP促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的的轉(zhuǎn)移，抑制其凋亡。因此，在未來，VCP可能預(yù)測(cè)腫瘤的轉(zhuǎn)移及預(yù)后，為腫瘤的靶向治療提供途徑。