原花青素在防控分泌性腹瀉中的研究進(jìn)展

徐 靜，王 幸，雷 蕾，帥 柯,2，楊漢博,2*

（1.成都思來生物科技有限公司，四川成都 610041；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，四川成都 611130）

原花青素又稱原花色素、縮合鞣質(zhì)，是以黃烷-3-醇和黃烷-3，4-二醇（兒茶素或表兒茶素）為構(gòu)成單元，以C-C 鍵結(jié)合方式聚合而成的一類黃酮化合物，普遍存在于花生衣、葡萄籽、松樹皮、高粱皮、龍血巴豆等植物中，已被證實具抗氧化、抗炎等功能[1-3]。近年來，原花青素的抗分泌性腹瀉功能被逐漸發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)。分泌性腹瀉是某些病原菌（如產(chǎn)腸毒素大腸桿菌、霍亂弧菌等）、病毒（如輪狀病毒）、炎癥過程、藥物、遺傳等因素引起腸液分泌增多為主要特征、伴有吸收障礙的腹瀉[4]。飼料中禁止添加抗生素、限量添加鋅等政策實施后，斷奶仔豬腹瀉率升高、耗料增重比升高等關(guān)聯(lián)性問題逐漸凸顯，特別是產(chǎn)腸毒素大腸桿菌導(dǎo)致的斷奶仔豬腹瀉問題嚴(yán)重影響?zhàn)B殖生產(chǎn)效率，養(yǎng)殖行業(yè)亟需可有效預(yù)控分泌性腹瀉的物質(zhì)來解決該問題。本文就原花青素的生物活性、分泌性腹瀉和原花青素抗分泌性腹瀉機(jī)制等方面做一綜述，旨在為防控斷奶仔豬分泌性腹瀉提供理論依據(jù)。

1 原花青素的結(jié)構(gòu)與生物活性

1.1 原花青素的結(jié)構(gòu) 原花青素的基本構(gòu)成單元為黃烷-3-醇和黃烷-3，4-二醇（以兒茶素或表兒茶素為主），是典型的C6-C3-C6結(jié)構(gòu)的黃酮化合物。兒茶素或表兒茶素通常以C4-C8或C4-C6鍵聚合。根據(jù)聚合度不同，原花青素可分為低聚原花青素（聚合度2～5）、聚合原花青素（聚合度＞5，但仍易溶于水）和高聚原花青素（聚合度很高，且難溶于水）[1,3]。不同植物來源的原花青素含量、聚合度差異較大。Yamakoshi 等[5]研究表明，葡萄籽中原花青素含量為2%～8%（以葡萄籽干重計），其中低聚原花青素可達(dá)25%。劉睿等[6]研究發(fā)現(xiàn)，高粱皮中原花青素含量為1%～4%，但基本上為高聚原花青素。

原花青素的性質(zhì)主要取決于其聚合度的不同。原花青素含大量酚羥基，聚合度增大，收斂性能（與蛋白質(zhì)結(jié)合生成不溶于水的鞣酸蛋白）增強(qiáng)。不同聚合度的原花青素被腸道吸收的難易程度不同，聚合度越大，越難被吸收[7]。Dens 等[2]研究表明，原花青素聚合度為2～3 易被吸收、4～6 少量被吸收、7 以上則基本不被吸收。

1.2 原花青素的主要生物活性

1.2.1 抗氧化活性 原花青素是國際公認(rèn)的抗氧化性極強(qiáng)的天然抗氧化劑，抗氧化活性是維生素E 的50 倍，是維生素C 的20 倍，尤其是體內(nèi)抗氧化活性，是其他抗氧化劑難以媲美的[8]。原花青素的作用機(jī)制是其在體內(nèi)釋放H+，競爭性地與自由基結(jié)合并反應(yīng)，一方面，可保護(hù)脂質(zhì)不被氧化，阻斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；另一方面，經(jīng)反應(yīng)后產(chǎn)生的半醌自由基再通過親核加成反應(yīng)生成具有兒茶酸及焦酚結(jié)構(gòu)的聚合物，仍然具有很強(qiáng)的抗氧化活性[9-10]。

原花青素的抗氧化活性與濃度、聚合度、羥基位置、連接方式、空間構(gòu)型、溶劑等等均有關(guān)系。其活性呈劑量-效應(yīng)關(guān)系，當(dāng)超出一定濃度范圍，其濃度升高，活性反而降低[8]。活性一般隨著聚合度增加而增加；C3位置的甲氧基化和糖基化會降低活性；C4-C8連接方式的活性大于C4-C6連接方式；以表兒茶素為單元的聚合后的活性大于以兒茶素為單元的聚合；在水相中活性增強(qiáng)，在油相中活性降低[11]。尹夢宇[12]選用ABTS、DPPH自由基清除法和鄰苯三酚自氧化法對原花青素進(jìn)行了體外抗氧化性能測定，確證了原花青素具有顯著的體外抗氧化效果；選定人體內(nèi)穩(wěn)定且最具有代表性的8-羥基脫氧鳥苷DNA 作為檢測對象，并與維生素C+維生素E 片劑對比，原花青素的抗氧化效果優(yōu)于維生素C+維生素E 組。

1.2.2 其他生物活性研究 除了抗氧化外，國內(nèi)外學(xué)者對原花青素的活性展開了大量研究，主要包括降血脂、抗炎、抗動脈粥樣硬化、抗癌、調(diào)節(jié)血糖、神經(jīng)系統(tǒng)性疾病、抗腹瀉等方面[13-17]。其中，原花青素在抗腹瀉上應(yīng)用成果最為突出。2012 年，美國食品和藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)Fulyzaq（商品名為Crofelemer）用于治療AIDS 患者的腹瀉癥狀；Crofelemer 提取自大戟科龍血巴豆的紅色乳膠，是一種平均分子量約為2 200 ku 的多種原花青素單體的隨機(jī)聚合的產(chǎn)物[18]。Crofelemer 是FDA 批準(zhǔn)的第二例植物藥，也是第一例口服植物藥，說明其安全性、有效性等方面均得到認(rèn)可，對于中醫(yī)藥進(jìn)入歐美市場和作為處方藥進(jìn)入西醫(yī)體系均具有史無前例的意義。唐青松等[19]研究表明，飼糧中添加500 mg/kg 和1 000 mg/kg 的縮合單寧能夠提高斷奶仔豬生長性能和緩解腹瀉，腹瀉率分別降低7.72%和60.97%。

2 分泌性腹瀉的發(fā)生原因及其機(jī)制

2.1 分泌性腹瀉發(fā)生原因 分泌性腹瀉的發(fā)生原因主要分為感染性和非感染性兩類，其中感染性因素包括細(xì)菌感染（如可產(chǎn)生腸毒素的產(chǎn)腸毒素大腸桿菌或霍亂弧菌等，具有侵襲性的志賀氏菌或沙門氏菌等）、輪狀病毒感染、寄生蟲感染（溶組織性阿米巴、隱孢子蟲），非感染性因素包括藥物副作用（艾滋病、癌癥藥物性作用）、自身免疫性疾?。冃阅c炎、克羅恩?。?、先天性疾?。ㄎ⒔q毛包涵性疾病、家族性腹瀉）。分泌性腹瀉臨床癥狀主要表現(xiàn)為一般不發(fā)熱、稀水便、無明顯的白細(xì)胞增多，但伴有脫水、機(jī)體消瘦等癥狀，脫水甚者易死亡[5,20]。

2.2 分泌性腹瀉發(fā)生機(jī)制 分泌性腹瀉發(fā)生機(jī)制與細(xì)胞內(nèi)介質(zhì)（cAMP、cGMP、Ca2+）濃度升高而引起的水和電解質(zhì)分泌增多、吸收受抑制有關(guān)。

產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（ETEC）、霍亂弧菌主要是通過升高細(xì)胞內(nèi)cAMP 或cGMP 濃度引發(fā)分泌性腹瀉。ETEC 生長過程中可產(chǎn)生熱敏性腸毒和（或）耐熱性腸毒素，而霍亂弧菌生長過程中可產(chǎn)生霍亂毒素。巧合的是，熱敏性腸毒素與霍亂毒素在空間結(jié)構(gòu)上具有高度相似性，均為大分子蛋白，由A、B 亞基組成，A 亞基為毒性基團(tuán)，B 亞基為受體識別基團(tuán)。首先，B 亞基與腸上皮細(xì)胞神經(jīng)節(jié)苷脂GM1 受體識別并結(jié)合，經(jīng)飽飲或其他作用進(jìn)入細(xì)胞，并在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)將A、B 亞基分離。然后，A 亞基具有ADP-核糖基化轉(zhuǎn)移酶活性，催化煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）轉(zhuǎn)化成核糖基化腺嘌呤二核苷酸（ADP-R），ADP-R 激活興奮性G 蛋白（Gsα蛋白）。最后，腺苷酸環(huán)化酶被Gsα蛋白激活，并催化三磷酸腺苷（ATP）轉(zhuǎn)化為環(huán)磷酸腺苷（cAMP），cAMP 濃度大幅升高，引發(fā)蛋白激酶A（PKA）破壞囊性纖維化跨膜調(diào)節(jié)傳導(dǎo)（CFTR）通道，使氯離子、水分大量外流進(jìn)入腸腔，超過正常的吸收能力，即發(fā)生分泌性腹瀉[21]。耐熱性腸毒素與熱敏性腸毒素、霍亂毒素有類似致瀉途徑，但不同的是，耐熱性腸毒素與腸上皮細(xì)胞神經(jīng)節(jié)苷脂GM1 受體結(jié)合后，激活的是腸上皮細(xì)胞的鳥苷酸環(huán)化酶，促使細(xì)胞漿中三磷酸鳥苷（cGMP）水平上升，最終引發(fā)分泌性腹瀉[22]。熱敏性腸毒素、霍亂毒素和耐熱性腸毒素引發(fā)的分泌性腹瀉常伴隨嚴(yán)重脫水，特別是熱敏性腸毒素和霍亂毒素是至今發(fā)現(xiàn)的最劇烈的致瀉毒素，動物發(fā)病后，若不及時救治，極容易出現(xiàn)脫水、機(jī)體消瘦，甚至死亡現(xiàn)象。

志賀氏菌、沙門氏菌主要是通過升高細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度引發(fā)分泌性腹瀉。志賀氏菌或沙門氏菌侵襲進(jìn)入腸上皮細(xì)胞后，刺激免疫細(xì)胞分泌IL-6、IL-8 和腫瘤壞死因子，引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，Ca2+濃度升高不僅會使鈣激活氯離子通道大量分泌氯離子，還會抑制鈉氫交換蛋白（NHE3），減少鈉離子吸收，最終電解質(zhì)大量丟失，水分外流，發(fā)生分泌性腹瀉[23]。

輪狀病毒也主要是通過升高細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度引發(fā)分泌性腹瀉。輪狀病毒進(jìn)入細(xì)胞后，其非結(jié)構(gòu)蛋白4（NSP4）識別整合素α1β2，并在腸神經(jīng)作用下使Ca2+濃度升高，Ca2+濃度升高除了使鈣激活氯離子通道大量分泌氯離子和抑制NHE3 外，還會抑制鈉-葡萄糖共同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（SLC5A1），減少鈉離子吸收，最終，電解質(zhì)和水分大量丟失，發(fā)生分泌性腹瀉[24]。

另外，受到各種因素的刺激，腸道內(nèi)源性腦啡肽酶、炎癥過程中產(chǎn)生的血管活性肽（VIP）和5-羥色胺（5-HT）、鈣-鈣調(diào)節(jié)蛋白、P-物質(zhì)等，也會間接使cAMP、cGMP 或Ca2+的濃度升高，引發(fā)分泌性腹瀉。例如，內(nèi)源性腦啡肽（一種腸道內(nèi)源性阿片肽，在小腸中有促吸收和抗分泌的作用）與腸道基膜δ受體結(jié)合，直接抑制腺苷酸環(huán)化酶的活性，但可被內(nèi)源性的金屬蛋白酶—腦啡肽酶快速降解為亮-腦啡肽和蛋-腦啡肽，降解物失去促吸收和抗分泌作用，發(fā)生分泌性腹瀉[25]。

2.3 斷奶仔豬腹瀉與分泌性腹瀉的關(guān)系 由于仔豬斷奶后胃腸道、免疫功能尚未發(fā)育健全，加之換料、轉(zhuǎn)群、應(yīng)激等因素影響腸道完整性及其正常功能導(dǎo)致的腹瀉，即非感染性腹瀉[26]；更重要的是由于感染以ETEC 為代表病原而發(fā)生的腹瀉，即感染性腹瀉。ETEC 導(dǎo)致腹瀉的流程大致分為2 個過程：第一步，ETEC 的菌毛（黏附素）可識別腸上皮細(xì)胞受體，并黏附到腸上皮細(xì)胞上；第二步，ETEC 生長過程中產(chǎn)生腸毒素，特別是熱敏性腸毒素，會迅速引發(fā)分泌性腹瀉。黏附素、內(nèi)毒素和腸毒素被認(rèn)為是ETEC 致瀉三要素，黏附素本身并無毒性，主要是將菌毛與腸上皮細(xì)胞黏附，以便于增殖；內(nèi)毒素在腸道發(fā)生損傷的情況下才能吸收入血，僅當(dāng)超過肝臟的解毒能力時才誘發(fā)炎癥；而腸毒素則是直接作用腸道上皮細(xì)胞致瀉，且該作用劇烈[27-28]。所以，斷奶仔豬的感染性腹瀉主要是分泌性腹瀉。

3 臨床上抗分泌性腹瀉藥物現(xiàn)狀

目前，人醫(yī)或獸醫(yī)上已使用的治療分泌性腹瀉藥物有洛哌丁胺、奧太曲、吩噻嗪、氯丙嗪、格列本脲、口服補(bǔ)液鹽（ORS）、消旋卡多曲等。其中，洛哌丁胺、ORS、消旋卡多曲應(yīng)用最廣。原花青素則是FDA 批準(zhǔn)用于抗分泌腹瀉的新藥[17,25]。

洛哌丁胺主要通過抑制腸道運(yùn)動、延長吸收時間來作用；奧太曲主要通過抑制促分泌素（如VIP 和5-HT）的釋放對神經(jīng)內(nèi)分泌瘤發(fā)揮作用；吩噻嗪和氯丙嗪主要通過抑制鈣-鈣調(diào)節(jié)蛋白，從而抑制激素刺激的cAMP效應(yīng)；格列本脲能作用于氯離子通道，減少分泌。這幾類藥物在分泌性腹瀉的不同治療方案中均有價值，但存在副作用大、毒性大的風(fēng)險，在適應(yīng)癥、適應(yīng)人群等方面上均有較大限制。

ORS 能有效補(bǔ)充機(jī)體損失的水和電解質(zhì)治療脫水，是臨床上最重要的輔助治療手段，可降低腹瀉死亡率約70%，但它并不能減少體液的流失、大便量或不能縮短病程。消旋卡多曲是通過抑制腦啡肽酶活性來提高腸道腦啡肽活性，進(jìn)而降低腸道隱窩細(xì)胞內(nèi)cAMP、Ca2+在腸道黏膜的濃度，減少水、電解質(zhì)的分泌，同時增加水、電解質(zhì)的吸收，可減少體液的流失或縮短病程，與洛哌丁胺、奧太曲等藥物相比，具有效果確切、安全性高的特點，但其原料生產(chǎn)成本很高。原花青素來源于植物，經(jīng)提取、分離、富集而成，成本更低、安全性更高。

4 原花青素抗分泌性腹瀉的機(jī)制

原花青素抗分泌性腹瀉的機(jī)制研究主要集中在作為ADP-核糖基化抑制劑或氯離子通道抑制劑，阻斷分泌性腹瀉發(fā)生途徑中某些環(huán)節(jié)。

4.1 ADP-核糖基化抑制作用 原花青素可抑制霍亂毒素或熱敏腸毒素A 亞基的ADP-核糖基化轉(zhuǎn)移酶活性，阻斷NAD 轉(zhuǎn)化成ADP-R，抑制后續(xù)引發(fā)的腹瀉效應(yīng)，即原花青素抑制了ADP-核糖基化作用。也就是說，A亞基相當(dāng)于產(chǎn)腸毒素細(xì)菌引發(fā)分泌性腹瀉的“啟動器”，而原花青素可以在它剛啟動之初就“失靈”。野田公俊等[29]采用胍丁胺分析法表明，聚合度2～6 的原花青素可不同強(qiáng)度地抑制霍亂毒素催化ADP-核糖基化胍丁胺的生成，其表征方法是測定[腺嘌呤-14C]ADP-核糖基化胍丁胺的放射活性，而兒茶素單體卻沒有該抑制作用，且蘋果、大黃、葡萄籽等不同來源的原花青素均具有該作用；兔回腸結(jié)扎法試驗進(jìn)一步表明，50 μg 原花青素可完全抑制由1 μg 霍亂毒素引起結(jié)扎腸道（10 cm）的體液積累。

4.2 抑制氯離子通道作用 原花青素抗分泌作用機(jī)制涉及靶向和抑制2 種不同的腸氯化物通道，即作為cAMP刺激的氯離子通道的CFTR 通道和CaCC 的抑制劑[30]。氯離子通道可認(rèn)為是引發(fā)水、電解質(zhì)外流的最后關(guān)卡，而原花青素 “鎮(zhèn)守最后一道門”。Tradtrantip 等[31]研究證實，Crofelemer 抑制了CFTR 通道，最大抑制率接近60%，IC50 為7 μmol/L，并在CFTR 的細(xì)胞外位點產(chǎn)生的電壓依賴性阻滯作用使通道閉合狀態(tài)穩(wěn)定，且在4 h 后最大抑制率仍保持30%以上（逆轉(zhuǎn)小于50%）；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Crofelemer 通過與電壓無關(guān)的抑制機(jī)制強(qiáng)烈抑制CaCC TMEM16A，最大抑制率＞ 90%，IC50為6.5 μM；Crofelemer 對2 個結(jié)構(gòu)無關(guān)的腸道Cl-通道的雙重抑制作用可解釋其腸道抗分泌活性。Poorvi[32]認(rèn)為，Crofelemer 用于緩解HIV 感染者接受抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法（ART）的非感染性腹瀉癥狀，確認(rèn)其機(jī)制正是通過阻斷胃腸腔中的氯離子通道來抑制氯離子的分泌，且具有耐受性好和安全性好的優(yōu)勢。Crutchley 等[33]、Jessica 等[34]試驗表明，Crofelemer 可有效減少旅行者腹瀉、霍亂等感染性腹瀉患者的水樣便量，并顯著縮短病程時間，口服耐受性好。也就是說，Crofelemer 可以同時應(yīng)用于非感染性和感染導(dǎo)致的分泌性腹瀉。需要說明的是，Crofelemer（SP-303）是聚合度為3～30、平均分子量2 200 ku 的原花青素。而Fisher 等[35]采用來源相同、未分離純化、主要成分占SP-303 質(zhì)量67%、平均分子量為3 000 ku 的SB-303 與SP-303 對比的結(jié)果顯示，SB-303 也具有抗分泌腹瀉的活性，雖然效果略弱于SP-303，但提取工藝和成本大幅減少，這為對純度要求不太高的領(lǐng)域（如飼料）具有很高的開發(fā)價值。

5 展 望

動物不發(fā)病或少發(fā)病是提高養(yǎng)殖生產(chǎn)效率的重要途徑之一，而斷奶仔豬感染性腹瀉防控工作一直是生豬養(yǎng)殖的痛點和難點。原花青素是通過抑制腸毒素或其他物質(zhì)導(dǎo)致的分泌亢進(jìn)的某個環(huán)節(jié)或多個環(huán)節(jié)來實現(xiàn)抗分泌性腹瀉的。需要注意的是，單獨使用原花青素可在一定程度上控制分泌性腹瀉，但保證腸黏膜正常結(jié)構(gòu)完整與功能也是抗分泌性腹瀉的基礎(chǔ)條件。因此，原花青素與腸黏膜保護(hù)物質(zhì)的組合使用將會是未來抗分泌性腹瀉的重要手段。