重復(fù)序列在牛亞科中的研究進(jìn)展

張 瑞 ，張?zhí)炝?，宋美華，徐凌洋，高會(huì)江，李俊雅，陳 燕*，高 雪*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193；2.山東省棲霞市莊園獸醫(yī)站，山東棲霞 265300）

重復(fù)序列（Repetitive Sequence）是指在整個(gè)基因組中以多個(gè)拷貝出現(xiàn)的核酸序列，分布在染色體不同位置，是真核生物基因組的重要組成部分[1-2]。最新研究表明，過(guò)去被認(rèn)為是“垃圾DNA”的重復(fù)序列在基因組中扮演著重要角色[3]，對(duì)物種進(jìn)化、基因遺傳變異、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等具有重要意義[4]。病毒或原核生物中的重復(fù)序列存在較少，而重復(fù)序列在真核生物中存在廣泛。從病毒、原核生物到真核生物，重復(fù)序列在基因組中的比例呈逐漸提高的趨勢(shì)：病毒中重復(fù)序列不足1%[4]；啤酒酵母為3.4%[4]；植物基因組中比例波動(dòng)很大，水稻的重復(fù)序列占35%[5]，大豆42%[6]，小麥80%[7]；哺乳動(dòng)物中比例較為穩(wěn)定，人類(lèi)重復(fù)序列為47%[8]，小鼠為42%[9]；牛亞科物種中，普通牛、歐洲野牛、大額牛的重復(fù)序列分別為48.81%[10]、47.03%[11]、48.13%[12]，非洲水牛中重復(fù)序列占37.21%，相對(duì)其他幾個(gè)牛種比例略低[13]。根據(jù)重復(fù)序列在基因組中的分布方式，可分為串聯(lián)重復(fù)序列（Tandem Repetitive Sequence）和散在重復(fù)序列（Interspersed Repetitive Sequence）。本文對(duì)重復(fù)序列的分類(lèi)和特點(diǎn)進(jìn)行綜述，重點(diǎn)關(guān)注串聯(lián)重復(fù)序列和散在重復(fù)序列在牛亞科中的研究進(jìn)展，并分析了這兩大類(lèi)重復(fù)序列在牛亞科物種進(jìn)化中的作用。

1 串聯(lián)重復(fù)序列

1.1 串聯(lián)重復(fù)序列的分類(lèi) 串聯(lián)重復(fù)序列是指核心重復(fù)單元以首尾相連的方式多次重復(fù)所組成的序列，廣泛存在于真核生物和部分原核生物基因組中，主要分布于染色體著絲粒和端粒區(qū)[14]，對(duì)有絲分裂和減數(shù)分裂中染色體的分離以及染色體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性至關(guān)重要[15-16]。根據(jù)串聯(lián)重復(fù)單元的長(zhǎng)度，串聯(lián)重復(fù)序列可分為3 大類(lèi)，即衛(wèi)星DNA（Satellite DNA，＞100 bp）、小衛(wèi)星DNA（Minisatellite DNA，10～100 bp）和微衛(wèi)星DNA（Microsatellite DNA，＜10 bp）[17]。

1.1.1 衛(wèi)星DNA 衛(wèi)星DNA 是指重復(fù)單元長(zhǎng)度大于100 bp的序列，是異染色質(zhì)的重要組成部分，一般為高度串聯(lián)重復(fù)，主要集中在中心體周?chē)蛠喍肆Ｌ帯４蠖鄶?shù)動(dòng)植物基因組衛(wèi)星DNA 在150～180 bp 或300～360 bp[18]，具有富含AT 的特點(diǎn)[2]。

1.1.2 小衛(wèi)星DNA 小衛(wèi)星DNA 也稱(chēng)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列（Variable Number Tandem Repeats，VNTRs），是指重復(fù)單元長(zhǎng)度在10～100 bp 的序列，一般為中度串聯(lián)重復(fù)，主要位于常染色質(zhì)區(qū)域，與基因的轉(zhuǎn)錄與調(diào)控等生物功能相關(guān)[19]。第一個(gè)小衛(wèi)星DNA 是由Weller 等[20]在人類(lèi)肌紅蛋白基因的內(nèi)含子中發(fā)現(xiàn)的。小衛(wèi)星的大小通常在細(xì)胞減數(shù)分裂期通過(guò)同源重組的擴(kuò)張和收縮而發(fā)生改變[21]。

1.1.3 微衛(wèi)星DNA 微衛(wèi)星DNA 又稱(chēng)為簡(jiǎn)單重復(fù)序列（Simple tandem repeats，STR），其重復(fù)單元一般在10 bp 以?xún)?nèi)[22]，通常為中度串聯(lián)重復(fù)，主要位于基因組非編碼區(qū)或內(nèi)含子區(qū)域[17,23-24]，是染色體上端粒的重要組成部分。

1.2 串聯(lián)重復(fù)序列的特點(diǎn)

1.2.1 衛(wèi)星DNA 的保守性 同一類(lèi)型衛(wèi)星序列具有高度的保守性，尤其是著絲粒區(qū)衛(wèi)星序列。1978 年，Macaya 等[25]通過(guò)密度梯度離心技術(shù)從?；蚪MDNA中分離出1.706、1.711a、1.711b、1.715、1.720、1.723 等8 種不同的衛(wèi)星DNA，其中1.706、1.711、1.720 衛(wèi)星序列相似性較高。1982 年，Taparowsky 等[26]提出了衛(wèi)星序列進(jìn)化的假設(shè)模型，并將衛(wèi)星DNA 分成了A、B 兩大家族。家族A 包括1.706、1.711a、1.720 衛(wèi)星序列，其來(lái)源于一個(gè)12 bp 的重復(fù)單元（GATCAGGCAA（G）CT）；而家族B 則包括1.715、1.711b 衛(wèi)星序列，來(lái)源于另外一個(gè)12 bp 的重復(fù)單元（A（T）CTCGGGGTTC C），但這些序列共同起源于一個(gè)9 bp（ATCGGGCTA）的簡(jiǎn)單重復(fù)序列。1996 年，Modi 等[27]通過(guò)Southern印跡雜交（Southern Blotting）和熒光原位雜交技術(shù)（Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）對(duì)偶蹄目下46 個(gè)物種進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)bovine-Pst 和著絲粒區(qū)特異性衛(wèi)星序列1.715 衛(wèi)星家族廣泛存在于反芻動(dòng)物中，結(jié)果表明這兩個(gè)家族在反芻物種間具有高度的保守性。Kopecna 等[28]2012 年利用激光顯微技術(shù)分離了10個(gè)?？品N群著絲粒特異性衛(wèi)星DNA-1.715 衛(wèi)星家族，并通過(guò)衛(wèi)星DNA 的保守性分析了它們之間的親緣關(guān)系，發(fā)現(xiàn)普通牛和野牛、亞洲水牛和非洲水牛4 個(gè)物種親緣關(guān)系更加緊密。2013 年，Melters 等[29]對(duì)282 個(gè)動(dòng)植物基因組分析發(fā)現(xiàn)，著絲粒區(qū)存在大量的串聯(lián)重復(fù)序列，其中普通牛、瘤牛、歐洲野牛、牦牛和水牛等物種著絲粒區(qū)存在680 bp（1.723 衛(wèi)星家族）和1 410 bp（1.715衛(wèi)星家族）兩類(lèi)重復(fù)序列，但兩者序列無(wú)相似性，且前者的豐度較低，密度更小，如在普通牛中，680 bp 的序列在基因組中所占比例為29%，而1 410 bp 的序列達(dá)到了71%。

1.2.2 微衛(wèi)星DNA 分布的不均性 微衛(wèi)星DNA 在基因組中分布具有不均性。人類(lèi)基因組中90%的微衛(wèi)星DNA是在近端粒區(qū)發(fā)現(xiàn)的[30]，由大量高度重復(fù)的TTAGGG序列組成，昆蟲(chóng)則由TTAGG 組成[31]。真核生物中，二堿基微衛(wèi)星DNA 豐度最高[32]，人及其他哺乳動(dòng)物以AC最為豐富，植物以AT 最豐富[33]。Adams 等[32]對(duì)71 個(gè)脊椎動(dòng)物基因組微衛(wèi)星序列進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)魚(yú)類(lèi)、爬行動(dòng)物和哺乳動(dòng)物的微衛(wèi)星含量最多，豐度分別為716.86 loci/Mbp、628.26 loci/Mbp、491.23 loci/Mbp，其中4-mer 微衛(wèi)星豐度最高，但2-mer 微衛(wèi)星密度最大；在普通牛中2-mer 密度達(dá)到1.8 kb/Mb，而6-mer 微衛(wèi)星密度只有148 bp/Mb。此外，利用不同的計(jì)算方法和軟件得到的微衛(wèi)星DNA 雖然存在差異，但結(jié)果均表明微衛(wèi)星并不是均勻的分布在染色體上，而是富集在重復(fù)序列豐富或者匱乏的地方。在?？苹蚪M中，不同染色體上微衛(wèi)星的豐度和密度各異，Y 染色體上最高，整體上與各染色體的長(zhǎng)度無(wú)關(guān)，而與GC 含量呈負(fù)相關(guān)[34]。

1.2.3 小衛(wèi)星和微衛(wèi)星DNA 的多態(tài)性 小衛(wèi)星DNA GC 含量豐富，具有高度多態(tài)性和不穩(wěn)定性[35]。研究發(fā)現(xiàn)，酵母、真菌、植物和高等真核生物在內(nèi)的大多數(shù)生物中都存在富含GC 的小衛(wèi)星序列，少部分AT 含量豐富的小衛(wèi)星傾向于形成回文序列和發(fā)夾結(jié)構(gòu)，使基因組的不穩(wěn)定性加強(qiáng)[36]。在人類(lèi)基因組中，小衛(wèi)星的平均突變率大于0.5%，其中高突變位點(diǎn)可達(dá)10%[35]。小衛(wèi)星的多態(tài)性及與基因組中其他類(lèi)似位點(diǎn)雜交的能力，使其可以作為個(gè)體鑒定的DNA 指紋圖譜[37]。Jeffers 等[38]以小衛(wèi)星作探針，對(duì)20 個(gè)英國(guó)白種人的血樣分析發(fā)現(xiàn)，DNA 指紋圖譜的一致性越高，個(gè)體間的親緣關(guān)系就越近，表明DNA 指紋圖譜具有個(gè)體特異性。Vasil'ev 等[39]利用小衛(wèi)星與牛屬（Bos）和野牛屬（Bison）中多個(gè)物種雜交獲得指紋圖譜，并根據(jù)雜交片段數(shù)量與個(gè)體血液組成之間的相關(guān)性，鑒定牛亞科中的種間雜交、屬間雜交以及遠(yuǎn)緣雜交的物種。Perret 等[40]利用牛亞科基因組Y 染色體上特異性小衛(wèi)星序列的遺傳多樣性，進(jìn)行胚胎著床前的性別鑒定。

Glowatzki 等[41]首次利用微衛(wèi)星對(duì)瑞士褐牛、西門(mén)塔爾牛、荷斯坦牛等進(jìn)行親子鑒定，解決了傳統(tǒng)檢測(cè)方法（如血型、血清蛋白、紅細(xì)胞酶等）無(wú)法鑒定的親子關(guān)系。Heyen 等[42]利用17 條染色體上的22 個(gè)微衛(wèi)星對(duì)5 個(gè)品種牛進(jìn)行了血緣關(guān)系分析。郭立平等[43]利用8 個(gè)微衛(wèi)星DNA 作為標(biāo)記對(duì)西門(mén)塔爾牛進(jìn)行親子遺傳關(guān)系的鑒定，既節(jié)約了成本，又填補(bǔ)了缺失的系譜信息。利用微衛(wèi)星的多態(tài)性不僅可以用于親子鑒定，還可用于研究基因與性狀及群體的遺傳關(guān)系。王斌等[44]利用微衛(wèi)星分析了宣漢牛體高、胸圍等生長(zhǎng)發(fā)育性狀，發(fā)現(xiàn)在11 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)上的59 個(gè)等位基因與生長(zhǎng)發(fā)育呈正相關(guān)，44 個(gè)等位基因與生長(zhǎng)發(fā)育呈負(fù)相關(guān)。與小衛(wèi)星相比，微衛(wèi)星DNA 指紋圖譜更適合進(jìn)行群體遺傳分析。張相倫等[45]利用20 個(gè)微衛(wèi)星序列作為標(biāo)記分析了西門(mén)塔爾牛、利木贊牛、魯西黃牛和利魯牛4 個(gè)牛群體間的遺傳關(guān)系。楊紅文等[46]針對(duì)黎平牛、關(guān)嶺牛等貴州地方牛品種，利用23 對(duì)微衛(wèi)星引物進(jìn)行了遺傳多樣性分析，結(jié)果表明其品種間的遺傳分化為71.3%，而品種內(nèi)為28.7%，其中思南牛與關(guān)嶺牛的遺傳距離最小、與黎平牛的遺傳距離最大。

1.2.4 串聯(lián)重復(fù)序列進(jìn)化快速 串聯(lián)重復(fù)DNA 的進(jìn)化似乎比預(yù)期快得多，累積突變、不等交換、大片段的復(fù)制影響串聯(lián)重復(fù)家族在較短時(shí)期內(nèi)發(fā)生改變[47]，其中衛(wèi)星DNA 通過(guò)擴(kuò)張和收縮而快速進(jìn)化[48]。Melters 等[29]利用生物信息學(xué)方法對(duì)不同物種的串聯(lián)重復(fù)序列進(jìn)行比較分析，結(jié)果表明幾乎所有動(dòng)植物基因組的著絲粒處都存在高拷貝的衛(wèi)星序列，但序列組成和長(zhǎng)度差異很大，且衛(wèi)星DNA 在物種間快速進(jìn)化，尤其當(dāng)分化超過(guò)5 000 萬(wàn)年，著絲粒重復(fù)序列相似度迅速降低。

此外，高階重復(fù)序列（Higher-order repeat，HOR）的形成也加速了串聯(lián)重復(fù)序列的進(jìn)化，增加了基因組的復(fù)雜性。α衛(wèi)星序列作為人類(lèi)基因組中最豐富的串聯(lián)重復(fù)序列，在基因組中以2 種形式存在：一種是作為長(zhǎng)度為170 bp 的重復(fù)單體，另一種是由2 個(gè)相鄰單體同時(shí)擴(kuò)增形成“ABABAB……”的高階重復(fù)序列[29]。這在其他哺乳動(dòng)物中也有發(fā)現(xiàn)，如小鼠、豬、牛、馬等[49]，表明這種形式在物種內(nèi)具有普遍性。?？频?.709 衛(wèi)星序列，經(jīng)過(guò)脈沖凝膠電泳等方法分析發(fā)現(xiàn)凝膠的單列中出現(xiàn)多個(gè)條帶，推斷牛科基因組中也存在類(lèi)似于人α 衛(wèi)星序列的大小不等的高階重復(fù)序列[50]。

2 散在重復(fù)序列

2.1 轉(zhuǎn)座子的分類(lèi) 散在重復(fù)序列是指重復(fù)單元在基因組中各不相連，而是以散在的形式存在于整個(gè)基因組中，又稱(chēng)為轉(zhuǎn)座元件或者轉(zhuǎn)座子（Transposable elements，TEs），一般為中度重復(fù)序列，幾乎存在于所有的真核生物中。在哺乳動(dòng)物中，1/3～1/2 的基因組序列由轉(zhuǎn)座子組成[51]，如人類(lèi)基因組中達(dá)到45%[8]，小鼠中為38%[9]，普通牛中為47%[10]。

根據(jù)轉(zhuǎn)座介導(dǎo)元素不同，可將轉(zhuǎn)座子分為兩大類(lèi)[52]。第一類(lèi)為反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子（Retrotransposon），是以RNA為中間媒介進(jìn)行轉(zhuǎn)座，為“復(fù)制-粘貼”型，包括長(zhǎng)末端重復(fù)（Long Terminal Repeat，LTR）和非長(zhǎng)末端重復(fù)（Non-Long Terminal Repeat，non-LTR），后者又由長(zhǎng)散在重復(fù)（Long Interspersed Nuclear Elements，LINE）和短散在重復(fù)（Short Interspersed Nuclear Elements，SINE）組成。第二類(lèi)為DNA 轉(zhuǎn)座子（DNA Transposon），以DNA 為中間體進(jìn)行轉(zhuǎn)座，為“剪切-粘貼”型。

2.2 轉(zhuǎn)座子的特點(diǎn)

2.2.1 轉(zhuǎn)座子的移動(dòng)性 20 世紀(jì)40 年代，美國(guó)科學(xué)家Barbara McClintock 在玉米基因組中首次發(fā)現(xiàn)可移動(dòng)的元素——轉(zhuǎn)座子[53]，它可以從基因組的一個(gè)位置“跳躍”到另一位置上。1999 年Haren[54]提出轉(zhuǎn)座子是一段不連續(xù)的DNA 片段，能夠在基因組內(nèi)或者不同基因組間從一個(gè)位置移動(dòng)到另一位置；Kidwell[55]認(rèn)為轉(zhuǎn)座子是具有改變基因組位置能力的DNA 序列；Piégu[56]2015年再次提到，轉(zhuǎn)座子能夠從宿主基因組內(nèi)染色體或質(zhì)粒的一個(gè)位置移動(dòng)到另外一個(gè)位置，并通過(guò)橫向轉(zhuǎn)移到新宿主的基因組上。

2.2.2 轉(zhuǎn)座子在不同物種基因組中的差異 不同類(lèi)型的轉(zhuǎn)座子在物種間所占比例有所差異。哺乳動(dòng)物基因組中的轉(zhuǎn)座子重復(fù)序列主要由LINE 和SINE 組成，其次是LTR 和DNA 轉(zhuǎn)座子[51]，人類(lèi)基因組中的比例分別為20%、13%、8% 和3%，小鼠中依次對(duì)應(yīng)的比例為19%、8%、10%和1%[8-9]。通過(guò)對(duì)普通牛、歐洲水牛、非洲水牛和大額牛4 個(gè)?？莆锓N的轉(zhuǎn)座子進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，LINE 轉(zhuǎn)座子的含量最高，均大于20%，其中歐洲野牛和大額牛的LINE 轉(zhuǎn)座子在基因組中的覆蓋率接近40%，最高可達(dá)到1.15Gb[12]；其次是SINE 和LTR 轉(zhuǎn)座子，所占比例在3%～18%不等；最后是DNA 轉(zhuǎn)座子，在基因組中含量最少（低于5%），可能與其缺少自主型轉(zhuǎn)座子有關(guān)[57]。

2.2.3 轉(zhuǎn)座子的分布與GC 含量和基因密度的關(guān)系 基因組中GC 含量和基因密度的不均勻性影響轉(zhuǎn)座子的分布。人類(lèi)基因組中，位于常染色體和X 染色體上的L1轉(zhuǎn)座子富集在GC 含量豐富的區(qū)域[8]。反芻動(dòng)物中的BovB、Bov-tA、Bov-A2 和ART2A 轉(zhuǎn)座子與基因密度呈負(fù)相關(guān)，主要集中在基因密度較低的區(qū)域；而較為古老的L2 和MIR 轉(zhuǎn)座子，則與基因密度呈正相關(guān)，主要富集在基因密度較高的區(qū)域[58]。在?；蚪M中，LINE轉(zhuǎn)座子主要集中在GC 含量較高的區(qū)域，而B(niǎo)ovB 則主要存在于GC 含量較低的區(qū)域[59]。

2.2.4 活性轉(zhuǎn)座子在基因組中的含量 大部分轉(zhuǎn)座子由于沒(méi)有完整的開(kāi)放閱讀框而失去活性，少部分可能是潛在具有活性的轉(zhuǎn)座子。人類(lèi)基因組中的轉(zhuǎn)座子只有0.05% 具有活性[60-61]，其中LINE 家族中只有部分L1轉(zhuǎn)座子具有活性[8]。牛基因組中的轉(zhuǎn)座子也大都失去活性，如文獻(xiàn)中報(bào)道的811 個(gè)完整的L1 轉(zhuǎn)座子中，只有73 個(gè)（9%）可能具有活性，而與L1 轉(zhuǎn)座子相比，BovB 在?；蚪M中的活性更低，1 248 個(gè)高度保守的BovB 轉(zhuǎn)座子中，只有9 個(gè)（0.72%）是具有活性的[58]。

2.3 散在重復(fù)序列對(duì)基因組的影響

2.3.1 轉(zhuǎn)座子對(duì)基因表達(dá)的影響 轉(zhuǎn)座子可以調(diào)節(jié)或改變基因表達(dá)。Tang 等[62]發(fā)現(xiàn)8 000 多個(gè)人類(lèi)特異性轉(zhuǎn)座子分布在4 900 個(gè)基因附近，包括編碼區(qū)、外顯子、內(nèi)含子、啟動(dòng)子等區(qū)域，影響基因的表達(dá)。有些轉(zhuǎn)座子可作為啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)等調(diào)控元件，在基因組中移動(dòng)時(shí)，可將其自身的調(diào)控元件轉(zhuǎn)移到新的位點(diǎn)上。當(dāng)轉(zhuǎn)座子插入到基因的5' 調(diào)控區(qū)域，可調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[63]，當(dāng)插入到基因內(nèi)時(shí)，為編碼蛋白的序列提供了原始的進(jìn)化材料。劉震等[64]分析了LTR 轉(zhuǎn)座子內(nèi)部的基因，通過(guò)GO 注釋發(fā)現(xiàn)這些基因在細(xì)胞代謝、催化活性等方面發(fā)揮作用。

2.3.2 轉(zhuǎn)座子的水平轉(zhuǎn)移對(duì)基因組的影響 哺乳動(dòng)物的轉(zhuǎn)座子在基因組間主要通過(guò)垂直傳播的方式進(jìn)行擴(kuò)散[51]，而轉(zhuǎn)座子的水平轉(zhuǎn)移（Horizontal Transfer，HT）也是基因組交流的一種方式[65]。在過(guò)去1.6 億年間，哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)座子發(fā)生水平轉(zhuǎn)移的事件至多20 起，而昆蟲(chóng)在5 000 萬(wàn)年中則有2 248 起水平轉(zhuǎn)移事件[66]。這表明與昆蟲(chóng)相比，哺乳動(dòng)物中發(fā)生水平轉(zhuǎn)移的事件很少，但水平轉(zhuǎn)移在基因組進(jìn)化中仍發(fā)揮著重要作用。如BovB 轉(zhuǎn)座子通過(guò)水平轉(zhuǎn)移將其傳播到包括非洲獸類(lèi)（如大象）、反芻動(dòng)物（如牛和鹿）、有袋動(dòng)物（如袋鼠）等多種哺乳動(dòng)物的基因組中[51]，促進(jìn)了哺乳動(dòng)物基因組之間的交流。

3 展 望

重復(fù)序列是生物基因組中的重要組成部分，在分子標(biāo)記、疾病診斷、動(dòng)植物育種等方面得到廣泛應(yīng)用。然而與人類(lèi)、模式生物及植物中的研究相比，牛亞科中重復(fù)序列的報(bào)道較少，尤其在基因調(diào)控活動(dòng)、生物功能、進(jìn)化機(jī)制等方面有待進(jìn)一步研究。高通量測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)和應(yīng)用推動(dòng)了基因組學(xué)在各個(gè)領(lǐng)域中的研究，為深入了解基因組中的重復(fù)序列等復(fù)雜結(jié)構(gòu)帶來(lái)革命性突破。同時(shí)，組學(xué)數(shù)據(jù)的大量積累促使生物信息學(xué)在重復(fù)序列的鑒定和研究方法上不斷推陳出新，為從比較基因?qū)W和多組學(xué)等層面研究牛亞科的遺傳與進(jìn)化提供可能，為深入解析牛亞科重復(fù)序列的鑒定、分類(lèi)、特征與功能預(yù)測(cè)等提供技術(shù)與海量數(shù)據(jù)支撐，也為進(jìn)一步挖掘重復(fù)序列的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、生物學(xué)功能及其在物種進(jìn)化中的作用提供了重要依據(jù)。