GJB2基因突變引起耳蝸功能改變的機(jī)制*

于一丁 趙雪雷 文鋮 李悅 于寧 黃麗輝

GJB2基因是最常見耳聾基因，主要編碼的縫隙連接蛋白26(connexin26，Cx26)是耳蝸中最重要的一種縫隙連接蛋白；縫隙連接系統(tǒng)在維持耳蝸內(nèi)的正常鉀循環(huán)及微環(huán)境中起重要作用。GJB2基因是耳蝸中表達(dá)最強(qiáng)的一種連接蛋白，參與構(gòu)成耳蝸中的縫隙連接(gap junction，GJ)系統(tǒng)，對(duì)于維持內(nèi)耳微環(huán)境及細(xì)胞間的協(xié)調(diào)穩(wěn)定具有重要作用。該基因突變引起的聽力損失并非全部為先天性，相當(dāng)部分患者于兒童期出現(xiàn)遲發(fā)性進(jìn)行性聽力損失，且程度及類型不同，無法單純以同一致病機(jī)制解釋[1]。GJB2基因突變后常導(dǎo)致多種不同類型及程度的聽力損失，其突變相關(guān)先天性耳聾可能由耳蝸發(fā)育障礙導(dǎo)致，而遲發(fā)性聽力損失則可能與耳蝸功能改變相關(guān)。

臨床上較少有針對(duì)GJB2基因突變患者耳蝸功能改變的相關(guān)研究，如耳蝸電位的改變情況，本文僅對(duì)GJB2突變?cè)斐傻亩侂娢患爸鲃?dòng)放大功能改變?cè)斐蛇t發(fā)性聽力損失的致病機(jī)制進(jìn)行綜述，為GJB2基因突變精確診斷及治療提供參考。

1 GJB2基因突變通過鉀離子循環(huán)障礙影響耳蝸功能

1.1GJB2基因維持耳蝸內(nèi)鉀循環(huán)作用 GJB2基因主要表達(dá)Cx26，與其他縫隙連接蛋白構(gòu)成耳蝸內(nèi)的縫隙連接系統(tǒng)，參與維持耳蝸中各種離子等物質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡，對(duì)耳蝸正常功能發(fā)揮著重要的生理作用。耳蝸結(jié)構(gòu)復(fù)雜，主要由三個(gè)充滿液體的腔室組成，即前庭階、中階和鼓階,中階內(nèi)充滿內(nèi)淋巴，含有較高的鉀離子及較低的鈉離子。鉀循環(huán)學(xué)說認(rèn)為，當(dāng)聲音刺激毛細(xì)胞時(shí)，纖毛上的非選擇性陽離子通道開啟，內(nèi)淋巴中的鈣離子、鉀離子等進(jìn)入毛細(xì)胞內(nèi)，隨后通過毛細(xì)胞底側(cè)壁的鈣離子依賴性鉀通道開啟，將鉀離子排入組織間隙，后經(jīng)支持細(xì)胞吸收后再次循環(huán)至內(nèi)淋巴中，縫隙連接被認(rèn)為在此過程中起關(guān)鍵作用，協(xié)助維持耳蝸內(nèi)淋巴的高鉀狀態(tài)[2,3]。縫隙連接參與鉀離子回收、供應(yīng)營養(yǎng)物質(zhì)和能量、傳遞細(xì)胞間信號(hào)及維持內(nèi)外淋巴液微環(huán)境等，Cx26形成的通道和半通道在通透性方面有很強(qiáng)的電荷選擇性，主要與陰離子的通透性相關(guān)，包括三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)、二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)等信號(hào)分子，在耳蝸細(xì)胞間信號(hào)傳遞及營養(yǎng)和能量供給中具有重要意義[4]。研究表明，ATP作為重要信號(hào)分子，參與引起支持細(xì)胞鉀依賴性內(nèi)向電流，協(xié)助支持細(xì)胞回收鉀循環(huán)中的鉀離子維持鉀循環(huán)正常功能[5]。GJB2基因突變可通過兩種方式影響耳蝸內(nèi)ATP釋放，一是GJB2基因突變后的縫隙連接通道對(duì)ATP的通透性下降[4]；二是Cx26單獨(dú)形成半通道直接參與釋放ATP等物質(zhì)，調(diào)節(jié)耳蝸功能[5]。Forge等[6]發(fā)現(xiàn)，GJB2基因突變后鉀循環(huán)受到影響，內(nèi)淋巴鉀離子平衡狀態(tài)遭到破壞；Lin等[7]將GJB2基因p.V37I位點(diǎn)變異敲入小鼠，小鼠出現(xiàn)輕度聽力損失，認(rèn)為是鼓室注射鉀離子后導(dǎo)致其清除速率降低，鉀循環(huán)障礙，引起鉀離子蓄積。綜上所述，Cx26對(duì)于維持耳蝸內(nèi)正常鉀循環(huán)發(fā)揮著重要的作用。

1.2鉀循環(huán)與耳蝸蝸內(nèi)直流電位(endocochlear potential，EP)的維持 1958年，David提出了耳蝸電生理的“電源學(xué)說”，血管紋基底膜細(xì)胞上的鉀離子通道KCNJ10與邊緣細(xì)胞共同維持中階內(nèi)淋巴中的EP[8]。EP由耳蝸內(nèi)正常的鉀離子循環(huán)及代謝保持，正常耳蝸毛細(xì)胞內(nèi)的靜息電位值大約為-60 mV，耳蝸內(nèi)電位與其形成在耳蝸毛細(xì)胞纖毛的內(nèi)外側(cè)絕對(duì)電位差約為+140 mV，構(gòu)成耳蝸內(nèi)所有生物電及聲-電轉(zhuǎn)換功能主要驅(qū)動(dòng)力，即“電源”。內(nèi)淋巴中高鉀環(huán)境主要來自于血管紋中多種細(xì)胞的協(xié)同作用，并由支持細(xì)胞和毛細(xì)胞等共同參與的鉀循環(huán)維持[3]；鉀循環(huán)對(duì)于維持內(nèi)外淋巴液之間鉀離子濃度差至關(guān)重要，鉀循環(huán)障礙時(shí)EP可出現(xiàn)改變，EP實(shí)際上是鉀離子的平衡電位[9]，正常耳蝸功能與耳蝸中鉀離子循環(huán)密切相關(guān)。

1.3EP降低導(dǎo)致耳蝸電位改變 耳蝸電位包括耳蝸微音電位(cochlea microphonics,CM)、總和電位(summating potential,SP)、復(fù)合動(dòng)作電位(compound action potiential,CAP)，分別反映外毛細(xì)胞功能、內(nèi)毛細(xì)胞功能狀態(tài)及耳蝸傳入通路功能狀態(tài)。當(dāng)鉀循環(huán)障礙時(shí)，EP下降，耳蝸“電源”關(guān)閉，毛細(xì)胞表皮板兩側(cè)的電勢差降低，導(dǎo)致各項(xiàng)耳蝸內(nèi)電活動(dòng)出現(xiàn)問題，直接引起外毛細(xì)胞功能下降及CM、SP、CAP等耳蝸電位改變。Wang等[10,11]采用靜脈注射速尿干擾鉀循環(huán)正常功能，發(fā)現(xiàn)耳蝸電位對(duì)EP有很強(qiáng)的依賴性，EP下降時(shí)，CM振幅下降、CAP閾值提高，耳蝸電位與EP具有很強(qiáng)的相關(guān)性。李興啟等[12]和孫偉等[13]使用同一電極在中階同時(shí)記錄豚鼠缺氧狀態(tài)下EP和SP、CAP的改變情況，發(fā)現(xiàn)EP下降后SP由正值變?yōu)樨?fù)值，SP/EP成比例變化，CAP閾值上升；Jacob等[14]發(fā)現(xiàn)EP可直接影響Corti器幾何形態(tài)，不同EP下耳蝸Hensen細(xì)胞和毛細(xì)胞位置改變，支持細(xì)胞通過向外毛細(xì)胞施加不同的機(jī)械負(fù)載調(diào)節(jié)外毛細(xì)胞形態(tài)影響其能動(dòng)性，也可能會(huì)造成耳蝸電位改變。以上研究說明鉀循環(huán)障礙引起EP的降低可以引起耳蝸電位改變。

1.4鉀循環(huán)障礙引起耳蝸其他微環(huán)境改變 耳蝸微環(huán)境對(duì)于維持耳蝸正常功能至關(guān)重要，其穩(wěn)定主要由鉀循環(huán)、鈣循環(huán)及谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)共同維持[15]。耳蝸毛細(xì)胞頂部纖毛處于中階的內(nèi)淋巴中，合適的微環(huán)境對(duì)于發(fā)揮外毛細(xì)胞正常的生理功能具有重要意義。在離體外毛細(xì)胞的能動(dòng)性研究中，鉀離子的濃度變化可以直接引起外毛細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，高鉀離子可引起細(xì)胞膜去極化，使胞內(nèi)鈣離子濃度升高，外毛細(xì)胞出現(xiàn)收縮[16]；Marcon等[17]使用含有不同濃度鉀離子的細(xì)胞外液注射至豚鼠鼓室，記錄其畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射(distortion product otoacoustic emission, DPOAE)變化，發(fā)現(xiàn)鉀離子濃度升高可導(dǎo)致DPOAE幅度下降，外毛細(xì)胞能動(dòng)性改變。

耳蝸內(nèi)鉀循環(huán)障礙可同時(shí)影響鈣循環(huán)及谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)。在內(nèi)外淋巴液中，鈣離子在內(nèi)外淋巴液中濃度相差10～100倍，EP作為耳蝸內(nèi)各項(xiàng)電位的“電源”，參與維持內(nèi)外淋巴液中正常鈣離子濃度差。Hakuba等[18]在沙鼠耳蝸缺血模型中發(fā)現(xiàn)，阻斷雙側(cè)椎動(dòng)脈造成耳蝸短暫缺血可以出現(xiàn)CAP閾值升高及內(nèi)淋巴液中谷氨酸濃度升高。推測缺血造成的鉀循環(huán)障礙引起的鉀濃度升高可導(dǎo)致支持細(xì)胞上谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)載體功能紊亂，導(dǎo)致谷氨酸蓄積，造成耳蝸傳入通路障礙，谷氨酸增多后過度激活毛細(xì)胞鈣離子通道引起鈣離子內(nèi)流，導(dǎo)致鈣超載；胞內(nèi)鈣離子濃度增加又引起鈣依賴型鉀離子通道開放，使細(xì)胞膜超極化，直接引起膜電位改變并降低外毛細(xì)胞功能[19]。同時(shí)，GJB2基因突變可導(dǎo)致Cx26的半通道功能出現(xiàn)障礙，影響其釋放ATP、一氧化氮(NO)等信號(hào)因子，可進(jìn)一步引起鈣離子失調(diào)，失調(diào)的鈣離子通過改變外毛細(xì)胞骨架的強(qiáng)度或電壓敏感性等機(jī)制降低外毛細(xì)胞的能動(dòng)性[20,21]。

2 GJB2基因突變直接導(dǎo)致耳蝸主動(dòng)放大作用障礙

GJB2基因突變還可通過直接導(dǎo)致耳蝸主動(dòng)放大作用障礙造成耳蝸功能下降[22～25]。在耳蝸支持細(xì)胞中，Cx26與Cx30為最主要的縫隙連接蛋白，參與維持耳蝸中鉀循環(huán)等正常生理功能；兩種縫隙連接蛋白在耳蝸內(nèi)的分布既有差異又有重疊，Deiters細(xì)胞及柱細(xì)胞胞體均分布大量Cx26及Cx30，可共同形成雜合型縫隙連接通道[7]；而Hensens細(xì)胞上則主要分布Cx26[26]。Cx30敲除小鼠的EP降低且與聽力損失程度一致，全聾時(shí)EP消失，說明EP下降是Cx30 敲除小鼠的主要致聾機(jī)制[27]。而Cx26敲除小鼠EP降低程度與耳聾下降程度并非完全相關(guān)，小鼠敲除Cx26后全聾時(shí)，EP仍可保持較高水平，因此有觀點(diǎn)認(rèn)為EP下降并非完全是GJB2基因突變的致病機(jī)制[23]。

GJB2基因突變小鼠聽力下降程度與EP下降程度并不成正比，甚至部分小鼠EP并未發(fā)生改變，故認(rèn)為GJB2基因突變直接導(dǎo)致耳蝸主動(dòng)放大功能障礙才是耳蝸功能下降的核心。近年來發(fā)現(xiàn)，在小鼠出生5天后敲除Cx26，小鼠出現(xiàn)了類似于臨床的遲發(fā)性聽力損失，即高頻開始的輕至中度進(jìn)行性聽力下降[24,25]；基因突變小鼠的耳蝸發(fā)育正常，無明顯毛細(xì)胞丟失，但DPOAE降低，EP降低程度與聽力減退程度并不直接相關(guān)，故認(rèn)為GJB2基因突變引起的遲發(fā)性聽力損失程度與EP下降并不完全相關(guān)，EP改變不是耳蝸功能下降的主要原因。Zong等[24]研究發(fā)現(xiàn)耳蝸主動(dòng)放大功能的受損程度逐漸加重，聽力損失逐漸從高頻擴(kuò)展到低頻，損傷程度也不同。Zhu等[25]發(fā)現(xiàn)將耳蝸Deiters細(xì)胞與外柱細(xì)胞中的Cx26敲除后，小鼠出現(xiàn)進(jìn)行性聽力下降伴DPOAE幅值降低，而EP幾乎沒有改變；Chen等[23]發(fā)現(xiàn)出生10天后敲除Cx26的小鼠表現(xiàn)為遲發(fā)性進(jìn)行性聽力下降，且聽力下降水平與EP降低水平無關(guān)，但外毛細(xì)胞的非線性電容在去極化方向上向右移動(dòng)，電壓依賴性的斜率減小，說明耳蝸外毛細(xì)胞功能改變，主動(dòng)放大功能降低。以上研究說明，GJB2基因突變可直接導(dǎo)致耳蝸主動(dòng)放大功能障礙。

3 小結(jié)

GJB2基因突變可導(dǎo)致不同程度及類型的聽力下降，Cx26構(gòu)成的縫隙連接系統(tǒng)在維持耳蝸內(nèi)的正常鉀循環(huán)及微環(huán)境中起重要作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，發(fā)育早期敲除Cx26可導(dǎo)致耳蝸發(fā)育障礙，Cx26構(gòu)成的縫隙連接還可能與葡萄糖、ATP、miRNA等大分子通透性有關(guān)，該基因突變?cè)斐啥伆l(fā)育期的細(xì)胞骨架及營養(yǎng)障礙，Corti器隧道無法打開，說明GJB2基因突變所導(dǎo)致的先天性耳聾致病機(jī)制為耳蝸發(fā)育障礙[23,28]。而該基因突變導(dǎo)致的遲發(fā)性聽力損失則可以用耳蝸功能改變進(jìn)行解釋，突變通過影響鉀循環(huán)造成EP下降，EP作為耳蝸內(nèi)電活動(dòng)的“電源”，直接或間接影響CM、SP、CAP等耳蝸電位；EP本質(zhì)上是鉀離子的平衡電位，鉀循環(huán)障礙后鈣循環(huán)、谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)均受到影響，耳蝸微環(huán)境成分發(fā)生改變，而處于其中的外毛細(xì)胞功能可能受到影響；EP還可通過影響Corti器形態(tài)導(dǎo)致外毛細(xì)胞主動(dòng)放大功能降低。但近年研究觀點(diǎn)認(rèn)為，突變導(dǎo)致的EP降低可能并非導(dǎo)致遲發(fā)性聽力損失出現(xiàn)的主要原因，而應(yīng)該是耳蝸外毛細(xì)胞主動(dòng)放大功能障礙，其具體的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

(致謝：衷心感謝解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉科研究所李興啟教授對(duì)本文的悉心指導(dǎo)。)