益氣養(yǎng)榮復(fù)經(jīng)方對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的卵巢早衰小鼠的治療作用及保護(hù)機(jī)制

李蘭，鐘達(dá)源，楊開鋒，周虹，肖小芹

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208）

卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）是指女性在40 歲之前發(fā)生的卵巢功能衰竭現(xiàn)象，主要表現(xiàn)為促卵泡激素（follicle Stimulating Hormone，F(xiàn)SH）和黃體生成素（luteinizing hormone，LH）降低，雌二醇（estradiol，E2）升高［1-2］，嚴(yán)重者可導(dǎo)致閉經(jīng)甚至不孕。POF的病因復(fù)雜，機(jī)制尚不清楚。目前研究表明其最常見的原因是自身免疫，其次是遺傳、代謝、理化因素、藥物和感染［3］。而與腫瘤化療藥物相關(guān)的POF 也日趨增加［4］。白介素－2（interleukin 2，IL－2）是一種具有廣泛活性的細(xì)胞因子，主要由T細(xì)胞激活，它可以促進(jìn)B細(xì)胞和NK細(xì)胞的增殖，是調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的重要因素［5-6］。腫瘤壞死因子－α（tumor necrosis factor－α，TNF－α）是一種重要的炎癥因子，主要由活化的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，它負(fù)責(zé)細(xì)胞中的各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，引起細(xì)胞壞死或凋亡，并參與某些免疫調(diào)節(jié)［7-8］。益氣養(yǎng)榮復(fù)經(jīng)方（YQYR）由黃芪、巴戟天、鐵皮石斛、黃精四種藥物組成，是湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院使用多年的院內(nèi)成方，對(duì)POF患者有很好的療效，但其對(duì)POF的潛在保護(hù)機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)采用腹腔注射環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）建立免疫損傷性POF動(dòng)物模型，觀察YQYR對(duì)模型小鼠的保護(hù)作用及對(duì)細(xì)胞因子IL－2、TNF－α變化的影響，為臨床治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

健康雌性C57BL/6 小鼠24 只，SPF 級(jí)，7～8 周齡，體質(zhì)量16～19 g，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（湘）2019－0004。全部小鼠經(jīng)陰道脫落細(xì)胞涂片篩查動(dòng)情周期正常，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)室，室溫20～25 ℃，相對(duì)濕度50%～60%，光照12 h 明暗交替，普通飼料飼養(yǎng)，自由攝食飲水。

1.2 藥物與主要試劑

益氣養(yǎng)榮復(fù)經(jīng)方：黃芪、巴戟天、鐵皮石斛、黃精以4∶3∶2∶2 的比例稱取，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科提供。環(huán)磷酰胺注射液粉末（國藥準(zhǔn)字H20160667，百特醫(yī)療貿(mào)易有限公司）。小鼠FSH ELISA 試劑盒（批號(hào)：20201009EN）、小鼠LH ELISA試劑盒（批號(hào)：20201009SP）、小鼠E2ELISA 試劑盒（批號(hào)：20201009NJ）、小鼠IL－2 ELISA 試劑盒（批號(hào)：20201009TR）、小鼠TNF－α ELISA 試劑盒（批號(hào)：20201009KQ），均購自江蘇晶美生物科技有限公司。

1.3 分組、造模及給藥

將24 只小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、陽性對(duì)照組和YQYR 組，每組6 只。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，除空白組外對(duì)其余小鼠進(jìn)行造模。取CTX 注射液粉末0.2 g，加入生理鹽水10 mL 配制試劑。因CTX 具有自限性，采用首次腹腔注射120 mg/kg，14 d 后每隔3 d 腹腔注射CTX 注射液30 mg/kg，共注射4 次，建立POF 小鼠模型?？瞻捉M小鼠腹腔注射與模型組等量的生理鹽水。

造模成功后第2 天開始灌胃給藥。參考《動(dòng)物藥理學(xué)》實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及人體表面積比例，即20 g 的小鼠與70 kg 的人換算關(guān)系計(jì)算每日灌胃劑量。陽性對(duì)照組給予0.3 mL 補(bǔ)佳樂水溶液；YQYR 組給予0.468 mL 中藥藥液（藥物濃度為1.0 g/mL）；空白組和模型組均給予0.3 mL生理鹽水；連續(xù)給藥14 d。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 小鼠動(dòng)情周期、生活行為觀察

適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，每天早8時(shí)采用瑞氏染色法進(jìn)行小鼠陰道涂片觀察，具體方法參考文獻(xiàn)［9］。觀察腹腔注射CTX后小鼠生活行為變化。

1.4.2 組織病理學(xué)檢查

取小鼠卵巢，標(biāo)本置于4%多聚甲醛溶液固定、脫水、包埋、HE染色，光鏡下觀察卵巢形態(tài)。

1.4.3 激素檢測

眼眶取血，離心后取上清液采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測血清FSH、LH和E2含量。

1.4.4 細(xì)胞因子檢測

ELISA法檢測血清免疫因子IL－2、TNF－α變化。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠動(dòng)情周期和生活行為變化比較

空白組小鼠有正常的動(dòng)情周期（動(dòng)情前期、動(dòng)情期、動(dòng)情間期和動(dòng)情后期）；與空白組小鼠相比，模型組小鼠動(dòng)情周期紊亂，無動(dòng)情期。見圖1。與空白組相比，模型組小鼠活動(dòng)減少，攀爬減少，反應(yīng)緩慢，偶有撕咬打架，身體毛發(fā)干燥，缺乏光澤，飲水量少于注射前；與模型組相比，YQYR 組和陽性對(duì)照組小鼠精神狀態(tài)和對(duì)刺激的敏感性有所改善。

圖1 小鼠陰道涂片細(xì)胞形態(tài)（瑞氏染色，×100）

2.2 各組小鼠卵巢組織結(jié)構(gòu)比較

空白組小鼠卵巢組織結(jié)構(gòu)正常，可見各級(jí)卵泡形態(tài)。見圖2。模型組小鼠卵巢組織未見繼發(fā)性卵泡或成熟卵泡，且閉鎖卵泡的數(shù)量顯著增加。見圖3。陽性對(duì)照組和YQYR 組小鼠的卵巢組織結(jié)構(gòu)明顯改善，各級(jí)卵泡明顯存在。見圖4～5。

圖2 空白組小鼠卵巢組織結(jié)構(gòu)

圖3 模型組小鼠卵巢組織結(jié)構(gòu)

圖4 陽性對(duì)照組小鼠卵巢組織結(jié)構(gòu)

圖5 YQYR組小鼠卵巢組織結(jié)構(gòu)

2.3 各組小鼠血清FSH、LH含量比較

與空白組相比，模型組小鼠血清FSH、LH 水平升高（P＜0.05），E2含量降低（P＜0.05）；與模型組相比，陽性對(duì)照組和YQYR 組小鼠的血清FSH、LH 水平均降低（P＜0.05），E2水平均升高（P＜0.05）。見圖6。

圖6 各組小鼠血清中的激素水平比較

2.4 各組小鼠血清IL－2、TNF－α含量比較

與空白組相比，模型組小鼠血清IL－2、TNF－α水平升高（P＜0.05）；與模型組相比，陽性對(duì)照組和YQYR組的IL－2、TNF－α水平均降低（P＜0.05）。見圖7。

圖7 各組小鼠血清中的細(xì)胞因子水平比較

3 討論與總結(jié)

POF的病因復(fù)雜，機(jī)制尚不清楚，而作為一種烷基化劑的化療藥物，CTX 已知會(huì)嚴(yán)重?fù)p害處在生殖期的年輕患者的卵巢，導(dǎo)致卵巢包膜增厚、卵巢顆粒細(xì)胞凋亡、血管損傷和大量卵泡停滯發(fā)育，引起閉經(jīng)、不育和POF［10-11］?；诖?，本研究選擇CTX 作為建立POF 小鼠模型的藥物。

FSH、LH 和E2是用于評(píng)價(jià)POF 的臨床指標(biāo)，由于目前尚無診斷POF 的金標(biāo)準(zhǔn)，僅激素指標(biāo)和臨床癥狀即可用于診斷，因此觀測激素指標(biāo)和臨床癥狀對(duì)于判斷POF 情況尤為重要［12］。在本研究中，空白組小鼠經(jīng)瑞氏染色顯示小鼠動(dòng)情周期正常，表現(xiàn)出明顯的動(dòng)情前期、動(dòng)情期、動(dòng)情后期和動(dòng)情間期。而注射CTX 注射液后，模型組小鼠動(dòng)情周期紊亂，長期停滯于動(dòng)情間期，無發(fā)情期。且與空白組相比，模型組小鼠還表現(xiàn)出FSH、LH 水平升高和E2水平降低。不僅如此，HE 染色顯示，與空白組相比，模型組小鼠卵巢組織的卵泡發(fā)育明顯受到破壞，初級(jí)和次級(jí)卵泡數(shù)目明顯減少，卵泡閉鎖數(shù)目明顯增加。卵泡閉鎖可發(fā)生在POF 的所有階段，是POF 在組織學(xué)上的標(biāo)志［13］。以上結(jié)果共同表明，本實(shí)驗(yàn)中的POF小鼠模型已經(jīng)成功建立。

經(jīng)藥物干預(yù)后，與模型組相比，YQYR 組和陽性對(duì)照組小鼠精神狀態(tài)明顯改善；在YQYR 組和陽性對(duì)照組小鼠卵巢組織中，均可觀察到初級(jí)卵泡、多層初級(jí)卵泡和次級(jí)卵泡，偶見卵泡閉鎖，說明小鼠卵泡發(fā)育已趨正常；激素水平結(jié)果表明，陽性對(duì)照組和YQYR組小鼠的FSH、LH 水平明顯降低（P＜0.05），E2水平明顯增加（P＜0.05）。以上結(jié)果表明YQYR 在生活行為、卵泡發(fā)育和激素水平層面對(duì)CTX 誘導(dǎo)的POF 小鼠具有保護(hù)作用。

目前，化療藥物誘導(dǎo)POF 的相關(guān)研究主要集中在細(xì)胞因子、外周血T 淋巴細(xì)胞亞群及相關(guān)抗體上［14-15］。IL－2 和TNF－α 是重要的免疫系統(tǒng)因子，可準(zhǔn)確反映人體免疫系統(tǒng)的狀態(tài)，在細(xì)胞凋亡、增殖和炎癥反應(yīng)等方面發(fā)揮著重要的作用［16-17］。卵巢儲(chǔ)備與卵巢炎癥密切相關(guān)，持續(xù)的炎癥會(huì)加速卵巢衰老［18］。莊粵冰［19］發(fā)現(xiàn)自身免疫性POF 患者的IL－2 明顯高于健康患者。IL－2 主要由活化的CD4+T 細(xì)胞組成，可促進(jìn)B 細(xì)胞抗體的增殖、分化和分泌，從而誘導(dǎo)濾泡性顆粒細(xì)胞凋亡。TNF－α 的功能與細(xì)胞凋亡和增殖有關(guān)，可通過旁分泌或自分泌誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和凋亡［20］。研究表明，在某些階段，血清和卵巢組織中TNF－α 表達(dá)的下調(diào)對(duì)受損的卵巢有保護(hù)作用，體內(nèi)TNF－α 水平的升高則會(huì)導(dǎo)致卵泡早期凋亡，從而加速卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡［21］。TNF－α 還會(huì)抑制粒細(xì)胞的雌激素合成和分泌，破壞卵泡的微環(huán)境［22］。在本研究中，模型組小鼠的IL－2、TNF－α 水平顯著升高，而經(jīng)藥物干預(yù)后，YQYR 組和陽性對(duì)照組小鼠IL－2、TNF－α 水平顯著降低（P＜0.05），說明YQYR 可通過調(diào)控炎性因子改善POF小鼠的卵巢受損情況。

綜上，YQYR 能夠有效調(diào)節(jié)CTX 誘導(dǎo)的POF 小鼠血清LH、FSH 和E2含量，降低血清中IL－2 和TNF－α的表達(dá)水平，改善垂體和卵巢內(nèi)分泌功能，抑制卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡，增強(qiáng)卵巢儲(chǔ)備能力，保護(hù)卵巢功能。