基于皮膚含水量、經(jīng)皮失水量及血清VEGF含量探討三黃消痤面膜對痤瘡的治療作用與機(jī)制

于坤良，王思農(nóng)，郭斐斐，牛凡琪

（甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000）

相關(guān)研究表明，痤瘡是一種皮膚屏障功能破壞的產(chǎn)物［1］。角質(zhì)層含水量、經(jīng)皮失水量通常用來測定皮膚屏障作用的正常與否，當(dāng)損傷發(fā)生時(shí)，皮膚儲(chǔ)水功能下降，丟失水分過多，會(huì)出現(xiàn)脫屑、過敏等病理反應(yīng)。VEGF（血管內(nèi)皮生長因子）作為一種促進(jìn)血管新生因子，通常在痤瘡發(fā)病過程中出現(xiàn)含量升高的情況，給瘢痕增生提供了可能性。本課題組通過觀察三黃消痤面膜對于痤瘡大鼠皮膚屏障功能的修復(fù)作用及對大鼠血清中VEGF 含量的影響，探討外用三黃消痤面膜治療痤瘡的可能途徑與機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)Wistar 大鼠48 只，雌性，4～8 周齡，體質(zhì)量（180±20）g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（甘）2019－0003。常規(guī)飼養(yǎng)大鼠，由固定配方的標(biāo)準(zhǔn)飼料進(jìn)行喂養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水，動(dòng)物房溫度20～25 ℃，濕度50%～70%，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后開始試驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品

治療用藥：三黃消痤面膜（甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院院內(nèi)協(xié)定處方，試生產(chǎn)階段，方中所用中藥顆粒劑由廣東一方制藥有限公司提供，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥房采購），組方為黃連、黃芩、黃柏、白及、白芷、茯苓、血竭、薄荷、冰片；0.025%維A酸乳膏（重慶華邦制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字：H50021820）。

造模用藥：100%油酸（天津市富宇精細(xì)化工有限公司提供，批號(hào)：101212）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

GPSkin Barrier測試儀（韓國GPOWER 公司）；大鼠血清VEGF ELISA試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

2 方法

2.1 藥物制備方法

黃連、黃芩、黃柏、白及、白芷、茯苓、血竭、薄荷等面膜配方所需的藥物顆粒均勻混合，再將冰片用乳缽研成細(xì)粉，上述藥物均勻混合，放入罐中待用。使用時(shí)按相應(yīng)給藥劑量取藥粉，加入熱蒸餾水中混勻，自然冷卻至室溫后，涂抹于無菌敷料上，通過醫(yī)用無紡布貼固定到大鼠造模處，每次用藥20 min。

2.2 動(dòng)物分組及造模方法

全部大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、三黃消痤面膜低劑量組（低劑量組）、三黃消痤面膜中劑量組（中劑量組）、三黃消痤面膜高劑量組（高劑量組）和維A酸乳膏組。除空白組外，對其余各組進(jìn)行造模，造模方法為于大鼠雙耳內(nèi)側(cè)耳廓導(dǎo)管開口處涂抹100%油酸，每次涂抹0.5 mL，每天1次，連續(xù)涂抹3周。造模結(jié)束后，抽取2 只模型大鼠，參照痤瘡組織學(xué)判定標(biāo)準(zhǔn)［3］，判斷滿足（+）～（+++）時(shí)表示大鼠痤瘡模型造模完成。見表1。

表1 痤瘡組織學(xué)標(biāo)準(zhǔn)

2.3 給藥方案

按照人和動(dòng)物體表面積折算的等效劑量比率表計(jì)算各治療組大鼠的給藥劑量。低、中、高劑量組給藥劑量分別為0.05、0.1、0.2 g/（kg·d），維A 酸乳膏組給藥劑量為5 g/（kg·d）。造模成功次日開始，按相應(yīng)劑量分別將三黃消痤面膜和維A酸乳膏均勻涂于各治療組大鼠的造模部位進(jìn)行治療，每日1 次，連續(xù)治療14 d。空白組、模型組不涂抹任何藥物［4］。

2.4 實(shí)驗(yàn)觀察指標(biāo)

無創(chuàng)性皮膚測試：采用韓國GPOWER 公司生產(chǎn)的GPSkin Barrier 測試儀，在同一時(shí)間、環(huán)境（室溫25～27 ℃，濕度50%～60%）下，分別于療程結(jié)束后6、24、48 h和7、14 d 時(shí)對大鼠皮膚含水量和經(jīng)皮失水量進(jìn)行測量，每處測量3 次，檢測結(jié)果取平均值。取鼠耳對造模部位進(jìn)行HE 染色及形態(tài)學(xué)和病理學(xué)觀察。治療后各組大鼠心臟取血，離心取上清液，采用ELISA 檢測血清VEGF含量，具體操作方法參照試劑盒說明書。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0 對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示計(jì)量資料，組間比較采用配對樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05 代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠治療前后耳廓皮損的病理改變情況

空白組大鼠耳廓皮脂腺體積正常，角質(zhì)層未見明顯增厚。模型組大鼠耳廓皮脂腺體積明顯增大，大量炎細(xì)胞浸潤，角質(zhì)層增厚明顯，皮脂腺導(dǎo)管開口處角化異常明顯。治療后，維A 酸乳膏組皮脂腺體積變小，炎細(xì)胞浸潤減少，角質(zhì)層增厚較前減輕。低劑量組皮脂腺體積變小，炎細(xì)胞浸潤較前減少，角質(zhì)層增厚減輕。中劑量組皮脂腺體積變小，皮脂腺導(dǎo)管開口處角化物質(zhì)堆積減少，炎細(xì)胞浸潤數(shù)目減少。高劑量組皮脂腺體積明顯變小，偶見炎細(xì)胞浸潤，角質(zhì)層增厚明顯改善，皮脂腺開口處未見角化物質(zhì)堆積現(xiàn)象。見圖1。

圖1 各組大鼠耳廓皮損的病理改變情況（HE，×100）

3.2 各組大鼠治療前后皮膚角質(zhì)層含水量的比較

與空白組比較，模型組大鼠耳廓角質(zhì)層含水量明顯下降（t=20.26，P＜0.01）。治療后，與模型組比較，維A酸乳膏組及低、中、高劑量組大鼠角質(zhì)層含水量明顯升高（t1= －8.78，t2= －9.49，t3= －12.15，t4=－27.24，P＜0.01）。低劑量組與維A 酸乳膏組大鼠相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t5= －0.41，P＞0.05），而中、高劑量組與維A酸乳膏組大鼠相比，角質(zhì)層含水量上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t6=－5.35，t7= －6.18，P＜0.05）。見表2、圖2。

圖2 各組大鼠耳廓皮膚角質(zhì)層含水量變化

表2 各組大鼠耳廓皮膚角質(zhì)層含水量變化情況［xˉ±s，n=8，g/（h·cm2）］

3.3 各組大鼠治療前后皮膚經(jīng)皮失水量的比較

與空白組比較，模型組大鼠皮損經(jīng)皮失水量明顯上升（t=－12.08，P＜0.05）。治療后，與模型組比較，維A酸乳膏組及低、中、高劑量組大鼠皮膚經(jīng)皮失水量明顯下降（t1= 3.46，t2 =4.11，t3= 4.87，t4= 7.30，P＜0.05）。低劑量組與維A酸乳膏組大鼠相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= 1.55，P＞0.05），而中、高劑量組與維A酸乳膏組相比，皮膚經(jīng)皮失水量明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t5= 5.72，t6= 11.61，P＜0.05）。見表3、圖3。

圖3 各組大鼠耳廓經(jīng)皮失水量情況

表3 各組大鼠耳廓皮膚經(jīng)皮失水量變化情況［xˉ±s，n=8，g/（h·cm2）］

3.4 各組大鼠治療前后血清中VEGF含量的比較

與空白組比較，模型組大鼠血清中VEGF 的含量明顯升高（t= －24.26，P＜0.01）。治療后，與模型組比較，維A 酸乳膏組及低、中、高劑量組血清中VEGF含量明顯下降（t1= 16.85，t2= 20.81，t3=21.88，t4= 25.09，P＜0.01）。低劑量組與維A 酸乳膏組相比，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t5= 1.14，P＞0.05）。中、高劑量組與維A 酸乳膏組相比，血清中VEGF 含量明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t6=－4.97，t7= 7.20，P＜0.01）。見表4。

表4 各組大鼠血清中VEGF含量變化情況（xˉ±s，n=8）

4 討論

當(dāng)外界刺激如細(xì)菌、病毒、物理損傷來襲時(shí)，皮膚的屏障與免疫功能遭到破壞，表面微生物寄生的微環(huán)境失衡，各種損害也會(huì)相繼產(chǎn)生［2］。研究表明，各種損傷因素會(huì)誘導(dǎo)雄激素含量失調(diào)、皮膚油脂分泌異常且發(fā)生成分改變和pH值改變，導(dǎo)致出現(xiàn)粉刺、紅斑、丘疹及膿皰，修復(fù)不良時(shí)還會(huì)導(dǎo)致瘢痕形成［3－4］。因此，在痤瘡的治療中修復(fù)皮膚屏障功能越來越受到人們的關(guān)注。VEGF 在病理改變中的異常增殖是痤瘡瘢痕發(fā)生的早期改變，因此，降低血清中VEGF 表達(dá)，可抑制痤瘡瘢痕形成［5－6］。本次研究旨在觀察三黃消痤面膜對痤瘡大鼠皮膚含水量、經(jīng)皮失水量、VEGF 含量的影響，探討其對于痤瘡可能的治療途徑。

面膜作為一種美容保養(yǎng)品的載體，以其獨(dú)特的作用機(jī)理，近年來被廣泛應(yīng)用于皮膚病的治療過程中。中藥面膜是以中藥粉或中藥加工品配合一定的成膜材料，均勻涂抹在患者面部的一種外用涂劑［7］。使用面膜治療痤瘡不僅可以將外來刺激進(jìn)行短暫隔絕，形成皮損局部的封閉環(huán)境，還可以擴(kuò)張毛孔，提高代謝，增強(qiáng)角質(zhì)層水合程度，促進(jìn)藥物有效滲透。面膜在揭去的同時(shí)，可以帶走皮膚代謝產(chǎn)物、多余分泌的皮脂及壞死細(xì)胞，達(dá)到清潔作用，減少炎細(xì)胞及菌群的數(shù)量，恢復(fù)皮膚表面微環(huán)境的動(dòng)態(tài)平衡［8］。另一方面，面膜作為藥物成分的載體，能夠使抗炎消腫、活血散瘀的藥物更好地透皮吸收，通過藥物的表皮作用途徑，改變皮損部位的炎癥因子聚集現(xiàn)象、痤瘡丙酸桿菌異常增殖現(xiàn)象和瘢痕形成前期的毛細(xì)血管增生現(xiàn)象，進(jìn)而抑制痤瘡皮損的炎癥反應(yīng)、炎性色素沉著和可能的瘢痕遺留問題。三黃消痤面膜是我院皮膚科的院內(nèi)協(xié)定處方，臨床運(yùn)用效果較好，且不良反應(yīng)發(fā)生率低，但其對痤瘡的治療機(jī)制尚未明確，故在本次實(shí)驗(yàn)中對其進(jìn)一步研究，探討其對于痤瘡的治療機(jī)理。

中醫(yī)學(xué)多從清熱解毒祛風(fēng)的角度論治痤瘡。在《外科啟玄》一書中提出了痤瘡血熱發(fā)病的病機(jī)，并采用清肺涼血、活血化瘀的原則進(jìn)行治療。三黃消痤面膜以面膜為藥物載體，運(yùn)用活血化瘀、清熱涼血的中藥來治療痤瘡。方中用藥多苦寒清熱，其中黃芩入肺胃經(jīng)，清肺胃濕熱，涼血；黃連入心脾經(jīng)，清心脾濕熱，理氣機(jī)；黃柏入腎經(jīng)，清濕熱退虛熱；白及苦甘澀寒，入肺胃腎經(jīng)，清肺熱補(bǔ)腎水，涼血且能消腫生肌；白芷辛溫歸肺胃經(jīng)，祛在表之風(fēng)邪，消腫止痛，燥濕排膿，調(diào)和諸藥之寒涼傷胃；茯苓甘淡性平，驅(qū)邪扶正，主利水消腫，補(bǔ)益正氣；血竭甘咸性平，歸肝經(jīng)，活血化瘀，止痛生??；薄荷辛涼，入肺肝經(jīng)，透疹，散在表之風(fēng)邪；冰片性辛苦寒，歸心脾肺經(jīng)，增強(qiáng)清熱涼血之效。全方清三焦血熱，兼能活血化瘀。現(xiàn)代藥理研究表明，黃芩中的有效成分黃芩苷可提高皮膚抗氧化能力，減輕痤瘡炎癥反應(yīng)［9］。黃連具廣譜抗菌作用，可抑制痤瘡丙酸桿菌過度增殖［10］，且黃連中所含的黃連多糖具有抗氧化作用，能夠減緩細(xì)胞凋亡與異常角化，修復(fù)皮膚微環(huán)境平衡［11］。黃柏可抑制免疫反應(yīng)，減輕炎癥反應(yīng)［12］。白及可促進(jìn)上皮細(xì)胞及組織形成，促進(jìn)表皮新生，修復(fù)表皮損傷［13］。白芷在抑制炎癥反應(yīng)的同時(shí)可以平衡激素水平，維持雌雄激素動(dòng)態(tài)平衡［14］。茯苓能夠增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，增強(qiáng)皮膚抵御外界刺激的能力［15］。血竭促進(jìn)表皮修復(fù)的功能主要體現(xiàn)在促進(jìn)Ⅰ型膠原形成，減少Ⅲ型膠原形成，在促進(jìn)愈合的同時(shí)預(yù)防和減少瘢痕形成［16］。薄荷抗菌作用顯著，且能促進(jìn)藥物透皮吸收［17］。冰片在消炎抑菌的同時(shí)，與薄荷相輔，增加角質(zhì)層儲(chǔ)藏功能，促進(jìn)藥物經(jīng)皮吸收［18］。諸藥合用，在清熱涼血，祛風(fēng)散結(jié)的同時(shí)，配合面膜載體增強(qiáng)皮膚角質(zhì)層含水量，減少經(jīng)皮失水量，恢復(fù)皮膚表面菌群平衡，促進(jìn)皮膚屏障功能的修復(fù)。

本次實(shí)驗(yàn)從皮膚屏障修復(fù)功能的角度探討三黃消痤面膜治療痤瘡的作用機(jī)制，結(jié)果表明三黃消痤面膜可以增加表皮含水量，減少經(jīng)皮失水量，調(diào)節(jié)血清VEGF含量，從而達(dá)到治療痤瘡的效果。