宮頸病變中濕熱證分布及其與miR－10b表達(dá)的相關(guān)性研究

吳冬梅，劉倩，龔婷婷，陳秋燕，劉用誠(chéng)

（福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院，福建 福州 350003）

宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）是浸潤(rùn)性宮頸癌的前期病變，分為低級(jí)別鱗狀上皮 內(nèi)病變（low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL）和高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變（high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL）。中醫(yī)辨治多從“帶下病”入手，主要證候?yàn)闈駸醿?nèi)蘊(yùn)［1－4］，主要治法為清熱祛濕［5－8］。有研究表明，在宮頸癌變進(jìn)程中，miR－10b 可以通過(guò)靶向抑制HOXA1 基因發(fā)揮抑癌基因功能［9－12］。但濕熱證在宮頸病變不同病理級(jí)別中分布特征如何，在病變進(jìn)展中是否發(fā)揮作用尚不清楚。本研究旨在通過(guò)研究宮頸病變不同病理級(jí)別中濕熱證的分布及中醫(yī)證候積分、miR－10b 的表達(dá)差異，為中醫(yī)藥防治本病提供理論依據(jù)。

1 臨床資料

1.1 一般資料

選取2020年7月—2021年7月就診于福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院宮頸癌早期防治工作室，經(jīng)宮頸三階梯診療程序篩查，宮頸病理檢查確診為L(zhǎng)SIL、HSIL和早期宮頸癌的新發(fā)患者，共139例。

LSIL 組71 例，年齡25～57 歲，（39.20 ± 8.39）歲；HSIL組45例，年齡24～56歲，（41.11±8.04）歲；早期宮頸癌組23例，年齡26～51歲，（40.70±6.51）歲。3組患者一般情況經(jīng)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本課題經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)

CIN 參照2014 版WHO 女性生殖系統(tǒng)腫瘤分類(lèi)中宮頸病變的分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)［13］。LSIL：鱗狀上皮基底及副基底樣細(xì)胞增生，細(xì)胞核極性輕度紊亂，有輕度異型性，核分裂象少，局限于上皮下1/3層，p16染色陰性或在上皮內(nèi)散在點(diǎn)狀陽(yáng)性。HSIL：細(xì)胞核極性紊亂，核漿比例增加，核分裂象增多，異型細(xì)胞擴(kuò)展到上皮下2/3 層甚至全層，p16在上皮大于2/3層面內(nèi)呈彌漫連續(xù)陽(yáng)性。

宮頸癌診斷標(biāo)準(zhǔn)參考中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)婦科腫瘤專(zhuān)業(yè)委員會(huì)發(fā)布的2021 版《子宮頸癌診斷與治療指南》［14］：早期宮頸癌指FIGO分期為Ⅰa2～Ⅱa2。

1.2.2 中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)

參照談?dòng)轮骶幍牡? 版《中醫(yī)婦科學(xué)》中“帶下病”的診斷方法和《中醫(yī)病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》中的辨證分型擬定。并結(jié)合前期研究研制的陰道鏡影像表征證候望診調(diào)查表將濕熱證陰道鏡下征象納入辨證資料：宮頸分泌物色黃或膿性，宮頸病變部位顏色鮮紅，質(zhì)脆、易觸血，宮頸病變部位血管顏色鮮紅、質(zhì)地可以為細(xì)小、點(diǎn)狀［15－16］。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)

①經(jīng)宮頸三階梯診療程序篩查，宮頸病理檢查確診為CIN，宮頸癌；②無(wú)放化療、免疫學(xué)治療病史；③不合并其他嚴(yán)重疾病如惡性腫瘤等，以免影響中醫(yī)辨證；④自愿參加并簽署知情同意書(shū)。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn)

①精神疾病患者，或合并其他全身性急、慢性疾病和患有其他惡性腫瘤者；②術(shù)后復(fù)發(fā)的宮頸病變、宮頸癌患者；③語(yǔ)言表達(dá)能力差，病情敘述有困難者；④拒絕配合者。

2 方法

2.1 中醫(yī)證候判定

按辨證標(biāo)準(zhǔn)將本病分為5 種證型：脾虛證、腎陽(yáng)虛證、陰虛夾濕熱證、濕熱下注證和濕毒蘊(yùn)結(jié)證。中醫(yī)辨證含濕熱證癥狀者即劃分為濕熱證組（可兼夾脾虛、腎虛、肝郁、熱毒），無(wú)濕熱證見(jiàn)癥者為非濕熱證組。

2.2 濕熱證中醫(yī)證候評(píng)分

應(yīng)用濕熱分級(jí)癥狀體征量化積分評(píng)定表將辨證含“濕熱證”的患者進(jìn)一步根據(jù)癥狀體征進(jìn)行中醫(yī)證候積分評(píng)定。濕熱證陰道鏡下征象納入積分。主證按無(wú)、輕、中、重依次計(jì)為0、3、6、9分，次證按無(wú)、輕、中、重依次計(jì)為0、1、2、3分。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)法測(cè)定宮頸病變組織中miR－10b的含量

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)：采集宮頸病變組織，在1 mL 經(jīng)TRIZOL 試劑裂解的組織勻漿樣品中加入0.2 mL 氯仿進(jìn)行兩相分離，對(duì)分離后的水相上層進(jìn)行RNA 沉淀－清洗－干燥－溶解處理，獲得RNA 溶液。使用紫外線吸收法測(cè)定RNA質(zhì)量，Nano Drop ND－1000檢測(cè)RNA濃度和純度（濃度計(jì)算公式：A260×40 ng/μL；純度：RNA溶液A260/A280的比值）。利用Applied Biosystems引物設(shè)計(jì)軟件（Primer 5.0，ViiATM 7 Real－time PCR System）設(shè)計(jì)相應(yīng)的RNA引物，引物（RT primers）由英駿生物技術(shù)有限公司協(xié)助合成。應(yīng)用ViiATM 7 Real－Time PCR System 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及PCR 反應(yīng)。miR－10b forward： AGCTGTTCAGTGCACTACAGA； miR－10b reverse：GTGCTACCCTGTAGAAC。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行錄入及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。組間構(gòu)成比的比較采用卡方檢驗(yàn)，計(jì)量資料滿足正態(tài)分布的多組比較采用方差分析，不滿足正態(tài)分布的采用非參數(shù)檢驗(yàn)；以P＜0.05代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 不同病理級(jí)別中濕熱證的分布特征

不同病理級(jí)別中濕熱證的構(gòu)成比比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。HSIL 組中濕熱證的構(gòu)成比高于LSIL組（P＜0.001），早期宮頸癌組中濕熱證的構(gòu)成比高于HSIL 組、LSIL 組（P＜0.001）。隨病理級(jí)別的增高，濕熱證分布增多。見(jiàn)表1。

表1 不同病理級(jí)別與濕熱證分布情況比較

3.2 不同病理級(jí)別中濕熱證中醫(yī)證候積分的比較

不同病理級(jí)別中濕熱證中醫(yī)證候積分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。早期宮頸癌組高于HSIL組、LSIL 組（P＜0.01），HSIL 組高于LSIL 組（P＜0.01）。隨病理級(jí)別增高，濕熱證候中醫(yī)證候積分明顯增加。見(jiàn)表2。

表2 不同病理級(jí)別濕熱證候中醫(yī)證候積分比較

3.3 不同病理級(jí)別患者宮頸病變組織中的miR－10b表達(dá)量比較

不同病理級(jí)別患者宮頸病變組織中miR－10b 相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。與HSIL 組、LSIL 組比較，早期宮頸癌組miR－10b 表達(dá)量明顯降低（P＜0.05），與LSIL 組比較，HSIL 組miR－10b 表達(dá)量明顯降低（P＜0.001）。隨著宮頸病變病理級(jí)別加重，miR－10b表達(dá)呈下降趨勢(shì)。見(jiàn)表3。

表3 不同病理級(jí)別miR－10b表達(dá)水平

3.4 濕熱證候與miR－10b表達(dá)量相關(guān)性的比較

濕熱證組和非濕熱證組miR－10b 相對(duì)表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，濕熱證組miR－10b表達(dá)量低于非濕熱證組（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 濕熱證組和非濕熱證組miR－10b表達(dá)量的比較

4 討論

宮頸上皮內(nèi)瘤變是宮頸癌變進(jìn)程中的關(guān)鍵時(shí)期，是預(yù)防宮頸癌發(fā)生的重要靶點(diǎn)階段。中醫(yī)藥以其獨(dú)特的臨床辨證思維和多成分、多靶點(diǎn)的治療作用，在防治CIN方面極具優(yōu)勢(shì)。綜合本團(tuán)隊(duì)前期和文獻(xiàn)研究可知，CIN屬于“帶下病”，最常見(jiàn)的證候因素是濕熱，濕熱內(nèi)蘊(yùn)為主要證型；臨床采用清熱祛濕法有較好的防治作用［1－8］。但是目前對(duì)宮頸癌前病變的中醫(yī)病因病機(jī)研究還不夠深入，對(duì)濕熱在宮頸癌變進(jìn)程中的作用機(jī)制尚不明了。

microRNA是非常重要的非編碼調(diào)控分子，它介導(dǎo)調(diào)控多細(xì)胞生物基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄后水平，已證實(shí)許多miRNA與多種類(lèi)型腫瘤的發(fā)生及發(fā)展相關(guān)，且在其中發(fā)揮關(guān)鍵作用。有研究表明在宮頸癌變進(jìn)程中，miR-10b 可通過(guò)靶向抑制HOXA1基因發(fā)揮抑癌基因功能，其表達(dá)量在宮頸上皮內(nèi)瘤變進(jìn)展為癌的過(guò)程中逐漸下降，且差異顯著，可以作為宮頸病變惡性轉(zhuǎn)化的分子標(biāo)志物［9－12］。

本研究發(fā)現(xiàn)，不同病理級(jí)別中濕熱證構(gòu)成比有顯著差異，隨病理級(jí)別增高，濕熱證分布增多，在早期宮頸癌組中證型為濕熱證的患者高達(dá)100%，濕熱證的中醫(yī)證候積分也明顯增高。研究結(jié)果提示，隨著宮頸病變從LSIL 進(jìn)展為HSIL，再到進(jìn)展為宮頸癌，濕熱是其中的基本病理要素，發(fā)揮了重要作用，在CIN 發(fā)生發(fā)展中，濕熱是致病的始動(dòng)因子，推動(dòng)病變。

CIN 病位在宮頸，多由不潔性交，令濕熱內(nèi)襲陰器、胞宮，累積任帶，使任脈失固、帶脈失約所致。宮頸是胞宮出口，是排月經(jīng)、泌帶液、娩出胎兒的通道，是易于創(chuàng)傷之地，也是邪氣易于感染、伏藏之處。HR－HPV 通過(guò)不潔性交侵入人體，深伏于宮頸，可達(dá)1～2年，初時(shí)無(wú)明顯臨床癥狀體征，隨著病毒持續(xù)感染，濕熱濁邪不斷耗傷正氣，進(jìn)而產(chǎn)生熱毒、痰瘀等病理產(chǎn)物。另一方面，由于機(jī)體長(zhǎng)期被邪氣侵犯，正氣不足，不能托邪外出，濕熱邪毒結(jié)于胞宮子門(mén)，進(jìn)一步加劇了宮頸病變發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸的動(dòng)態(tài)演變?！皾駸釢嵝啊笔菍?dǎo)致宮頸病變的主要病因，“濕熱積伏”胞宮是病變進(jìn)展演變的主要病機(jī)。濕與熱結(jié)，“熱得濕而熱愈熾，濕得熱而濕愈橫”。因此，“除濕”“清熱解毒”在宮頸病變的“既病防變”過(guò)程中非常重要。

本研究進(jìn)一步分析了宮頸病變不同病理級(jí)別中miR－10b的表達(dá)量以及濕熱證候與miR－10b表達(dá)量的相關(guān)性。結(jié)果顯示，隨著宮頸病變病理級(jí)別的加重，miR－10b的表達(dá)呈下降趨勢(shì)，這與鄒冬玲等［9－10］的研究結(jié)果一致，miR－10b 的表達(dá)差異可以反映宮頸癌變進(jìn)展，是很有前景的分子學(xué)標(biāo)志物。不僅如此，本次研究發(fā)現(xiàn)，miR－10b的表達(dá)也與濕熱證候有一定的相關(guān)性，濕熱證組的miR－10b表達(dá)量顯著低于非濕熱證組。宮頸癌前病變進(jìn)展的本質(zhì)是HR－HPV持續(xù)感染，致癌基因和抑癌基因發(fā)生異常表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞周期調(diào)控異常，以致宮頸上皮細(xì)胞異常增殖。濕熱是促進(jìn)宮頸病變進(jìn)展的重要病理因素，基于此可以得出，濕熱必然是通過(guò)影響細(xì)胞周期調(diào)控，誘導(dǎo)宮頸上皮細(xì)胞異常增殖導(dǎo)致宮頸癌前病變進(jìn)展的。其中可能的機(jī)制是濕熱邪毒可以抑制抑癌基因miR－10b表達(dá)，導(dǎo)致其靶向作用的mRNA表達(dá)異常，從而參與并調(diào)節(jié)宮頸癌發(fā)生與增殖過(guò)程。

本研究對(duì)宮頸上皮內(nèi)瘤變的基本病因病機(jī)做了初步探討，認(rèn)為濕熱是促使宮頸癌變進(jìn)展的重要病理要素，并且從分子生物學(xué)水平初步探討了濕熱致宮頸癌變的可能機(jī)制。目前國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，本研究為進(jìn)一步深入研究宮頸癌前病變的病因病機(jī)提供了一定的理論基礎(chǔ)。