三參丹飲預(yù)處理對(duì)心肌缺血再灌注損傷模型大鼠心肌的保護(hù)作用初探

韓淑麗，齊玲，姜文月，李鵬東，唐明哲

（清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院，廣東 清遠(yuǎn) 511500）

缺血性心臟病是世界范圍內(nèi)常見的高病死率疾病之一［1－2］。心肌缺血期引起的心肌超微結(jié)構(gòu)、能量代謝及電生理等損傷，在血管再通后反而呈現(xiàn)出加重的趨勢(shì)，稱為心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemiareperfusion injury，MIRI）。在MIRI過程中，常伴有代謝紊亂和心肌細(xì)胞死亡，心肌的再生能力極為有限，挽救心肌細(xì)胞至關(guān)重要。而凋亡因其發(fā)生具有可逆性，一直是細(xì)胞死亡調(diào)控研究的熱點(diǎn)。

心肌缺血根據(jù)癥狀應(yīng)歸屬中醫(yī)學(xué)“胸痹心痛”范疇，《肘后備急方》中記載：“胸痹之病，令人心中堅(jiān)痞忽痛，肌中苦痹，絞急如刺，不得俯仰，其胸前皮皆痛，不得手犯，胸滿短氣，咳嗽引痛，煩悶自汗出，或徹引背膂。不即治之，數(shù)日害人。”從其一系列臨床表現(xiàn)描述上不難看出，我國古代醫(yī)家對(duì)胸痹早有認(rèn)識(shí)，在治療上也各有側(cè)重?！蹲C治準(zhǔn)繩·雜病》認(rèn)為：“氣血不虛則不滯，既虛則鮮有不滯者，所以作痛”。清代王清任所創(chuàng)立的一系列活血化瘀名方，尤其是血府逐瘀湯，在后世也廣泛運(yùn)用于本病的治療。三參丹飲是國醫(yī)大師段富津教授治療胸痹心痛的常用處方，臨床療效顯著［3－4］，但其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。以往研究表明，缺血前預(yù)處理可以通過多個(gè)途徑減輕缺血后再灌注損傷的程度［5－7］。本研究以缺血前預(yù)處理作為對(duì)照，初步探索三參丹飲對(duì)MIRI大鼠心肌的保護(hù)作用。

1 材料、試劑與實(shí)驗(yàn)方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)Wistar雄性大鼠40只，體質(zhì)量（200±10）g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評(píng)價(jià)中心（GLP 實(shí)驗(yàn)室）提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（黑）2013004。于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)方藥分析實(shí)驗(yàn)室喂養(yǎng)，自由進(jìn)食攝水，飼養(yǎng)環(huán)境室溫（24±2）℃，相對(duì)濕度（55±3）%，通風(fēng)良好。

1.2 主要試劑及藥物

氨基甲酸乙酯（上海山浦化工有限公司，批號(hào)：20071010）；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）及丙二醛（malondialdehyde，MDA）測(cè)定試劑盒（中生北控生物科技股份有限公司，批號(hào)分別為：20130712、20130625、20130629、20130717）；三參丹飲（黃芪、白參、當(dāng)歸、川芎、丹參、三七、血竭，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥房提供）；生理鹽水（哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)有限公司，批號(hào)：100102A10）。

1.3 方法

1.3.1 分組及給藥

所有大鼠隨機(jī)分為三參丹組（SSD 組）、模型組（I/R 組）、假手術(shù)組（Sham 組）和缺血預(yù)處理組（PR組），每組10 只。SSD 組大鼠給予三參丹飲1.44 g/kg灌胃，其余各組大鼠灌胃等體積生理鹽水，在此期間，PR 組在給藥的基礎(chǔ)上，每天進(jìn)行3 次缺血－恢復(fù)灌注的預(yù)處理，每次5 min。連續(xù)給藥5 d后，除Sham 組外，其余各組大鼠行左前降支結(jié)扎－松解術(shù)以建立心肌缺血再灌注損傷模型，Sham 組大鼠只開胸，不進(jìn)行手術(shù)操作。

1.3.2 在體大鼠心肌缺血再灌注模型制備

麻醉前準(zhǔn)備及麻醉：大鼠在模型制備前12 h 可自由飲水，禁食。灌胃給藥（或給生理鹽水）后1 h 稱重，按1.0 g/kg 體質(zhì)量計(jì)算20%烏拉坦的給藥量，用5 mL注射器抽取烏拉坦并腹腔注射進(jìn)行麻醉，麻醉成功后令大鼠平躺，四肢及牙齒均固定在手術(shù)臺(tái)上。

連接心電機(jī)，按照右上肢紅色，左上肢黃色，左下肢綠色，右下肢黑色的連接方式，將電極針插入動(dòng)物四肢的皮下，連接好導(dǎo)聯(lián)線，進(jìn)行心電圖的記錄。

氣管插管：在頸部中線切約7 mm 小切口，用止血鉗鈍性分離筋膜及頸部肌肉，暴露氣管，過程中避免損傷甲狀腺。用眼科鑷小心剝離氣管，并穿過一雙股手術(shù)線備用。在氣管前面做一“V”字形小切口，開啟呼吸機(jī)（通氣量7～8 mL/kg，通氣頻率65～70 次/min，吸呼比1∶2，壓力4～5 kPa），迅速沿氣管方向輕輕送入導(dǎo)管，并用雙股手術(shù)線將導(dǎo)管與氣管固定。

開胸造模：于胸骨左側(cè)捫及心臟搏動(dòng)處稍偏左剪毛備皮，用75%酒精行術(shù)區(qū)消毒。用鑷子微微提起皮膚，手術(shù)刀行1 cm 縱向切口，再用止血鉗鈍性逐層分離肌層，使肋骨暴露，剪斷第四根肋骨，左手持止血鉗夾住靠胸骨側(cè)肋骨斷端稍稍提起，先用眼科鑷輕輕劃開心包膜，再用自制小動(dòng)物心臟手術(shù)器將心臟暴露于手術(shù)區(qū)，防止肋骨斷端劃傷心臟。心臟暴露后，找到左心耳，確定冠脈左前降支，在左心耳根部下方與肺圓錐之間進(jìn)針，用6/0 號(hào)無創(chuàng)縫合針穿過冠狀動(dòng)脈左前降支心肌表層約2 mm 穿出后，將50 號(hào)魚線用凡士林油紗布反復(fù)擦拭，墊于血管之上，打一手術(shù)方結(jié)，同時(shí)結(jié)扎魚線與血管，此時(shí)結(jié)扎線下段的血管已不隨心臟搏動(dòng)充盈，同時(shí)，心臟表面相應(yīng)區(qū)域顏色變暗后，立即將心臟輕柔地送回原位并關(guān)閉胸腔，用止血鉗將創(chuàng)口處的皮膚肌肉關(guān)閉，在創(chuàng)口表面覆蓋用生理鹽水沾濕的紗布。記錄時(shí)間，觀察心電圖出現(xiàn)波形異常高聳表明造模成功，結(jié)扎30 min后抽出墊在血管外的魚線，此時(shí)可觀察到冠脈左前降支血管逐漸隨心臟搏動(dòng)而有血流不斷充盈，恢復(fù)再灌注120 min。

棄用結(jié)扎、再灌注不成功，出血過多及呼吸心跳停止的大鼠。假手術(shù)組只穿線，不結(jié)扎。每組取8 只觀測(cè)指標(biāo)。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 心電圖檢查

實(shí)驗(yàn)大鼠麻醉后仰臥固定在手術(shù)臺(tái)上，用針灸針刺于四肢皮下，將各導(dǎo)聯(lián)夾連接于針柄上，右上肢連紅色導(dǎo)聯(lián)線，左上肢連接黃色導(dǎo)聯(lián)線，左下肢連接綠色導(dǎo)聯(lián)線，右下肢連接黑色導(dǎo)聯(lián)線。打開軟件，記錄心電圖，心電圖出現(xiàn)波形異常高聳表明造模成功。

1.4.2 血清指標(biāo)檢測(cè)

各組大鼠于恢復(fù)灌注120 min后，通過眼眶采血法收集血量約2 mL，離心收集上清。嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行LDH、CK、SOD和MDA指標(biāo)測(cè)定。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間數(shù)據(jù)比較用單因素方差分析，多重比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三參丹飲對(duì)MIRI大鼠血清LDH、CK水平的影響

與Sham組相比較，I/R組大鼠的LDH和CK水平均明顯升高（P＜0.01），表明I/R 組心肌損傷嚴(yán)重，MIRI大鼠模型制備成功；與I/R 組相比較，SSD 組及PR 組的LDH、CK水平明顯降低（P＜0.01）；但SSD組與PR組的LDH、CK 水平接近，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明PR組和SSD組對(duì)血清LDH、CK的水平作用相當(dāng)。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠血清LDH、CK水平比較（±s，U/L）

表1 各組大鼠血清LDH、CK水平比較（±s，U/L）

注：與Sham組比較，△△P ＜0.01；與I/R組比較，**P ＜0.01。

組別Sham組I/R組PR組SSD組n8 8 8 8 LDH 435.24±21.68 1 692.53±129.9△△928.34±95.36**919.12±88.97**CK 355.74±42.27 1 356.5±124.45△△834.25±68.26**859.49±84.24**

2.2 三參丹飲對(duì)MIRI大鼠MDA、SOD水平的影響

與Sham 組相比較，I/R 組大鼠MDA 水平明顯升高、SOD 水平明顯降低（P＜0.01），表明I/R 組大鼠心肌損傷嚴(yán)重；與I/R 組相比較，PR 組、SSD 組大鼠的MDA 水平均明顯降低，SOD 水平均明顯升高（P＜0.05，P＜0.01），表明PR 組及SSD 組大鼠心肌細(xì)胞得到了保護(hù)；但SSD 組與PR 組SOD、MDA 水平比較，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明兩組對(duì)大鼠心肌細(xì)胞受到的保護(hù)作用相當(dāng)。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠血清SOD、MDA水平比較（±s）

表2 各組大鼠血清SOD、MDA水平比較（±s）

注：與Sham 組比較，△△P ＜0.01；與I/R 組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

組別Sham組I/R組PR組SSD組n8 8 8 8 MDA（nmol/mL）1.75±0.16 3.82±0.33△△2.66±0.31**2.71±0.25**SOD（U/mL）146.05±12.83 72.46±6.27△△95.84±10.96**86.26±8.69*

3 討論

缺血性心臟病是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡的主要疾病之一。研究表明，將閉塞的冠狀動(dòng)脈再恢復(fù)灌注可有效降低總病死率，然而恢復(fù)缺血心肌血流可導(dǎo)致再灌注損傷，出現(xiàn)心肌細(xì)胞功能不全甚至引起心肌細(xì)胞死亡［8－10］。既往研究表明，MIRI有調(diào)控的可能，主要措施是針對(duì)缺血前或再灌注等過程進(jìn)行各種干預(yù)，其中公認(rèn)的比較有效的實(shí)驗(yàn)策略是缺血預(yù)處理及其藥物模擬試驗(yàn)［11－12］。本實(shí)驗(yàn)采用左前降支墊魚線結(jié)扎法進(jìn)行造模，該結(jié)扎方法在恢復(fù)灌注時(shí)尤其方便。通過監(jiān)測(cè)心電圖發(fā)現(xiàn)，冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎后心電圖波形異常高聳，急性心肌缺血表現(xiàn)明顯，這表明大鼠急性心肌缺血模型復(fù)制成功。而抽出魚線后可看到左前降支血管逐漸隨心臟搏動(dòng)而有血流充盈，提示手術(shù)成功復(fù)制了心肌缺血再灌注過程。

國醫(yī)大師段富津教授總結(jié)各代醫(yī)家用藥經(jīng)驗(yàn)所創(chuàng)立的三參丹飲，是其在臨床中辨證施治胸痹心痛病時(shí)的常用方劑，由白參、三七、川芎、當(dāng)歸、血竭、丹參、黃芪七味藥物組成。方中白參甘溫，大補(bǔ)元?dú)?，生津安神，為君藥；黃芪味甘，微溫，具有益氣固表的功效，為臣藥，君藥偏于補(bǔ)中益氣，臣藥偏于固護(hù)表氣，君臣相伍，可補(bǔ)一身內(nèi)外之氣；《本草匯言》中有記載：“芎?，上行頭目，下調(diào)經(jīng)水，中開郁結(jié)，血中氣藥，嘗為當(dāng)歸所使，非第活血有功，而治氣亦神驗(yàn)也”。當(dāng)歸味甘而重，能補(bǔ)血，其氣輕而辛，故又能行血，補(bǔ)中有動(dòng)，行中有補(bǔ)；川芎味辛，性溫，辛能發(fā)散，具有活血行氣之功，使之補(bǔ)而不滯；丹參善能通行血脈，祛瘀止痛；血竭具有活血止痛，散瘀生新之功效，助三七活血化瘀止痛，且活血而不傷血，均為佐藥。全方各藥相伍，使補(bǔ)氣而不氣滯、活血而不傷血，共奏益氣養(yǎng)血、活血化瘀之效［13］。

目前國內(nèi)外診斷急性心肌梗死的主要指標(biāo)包括天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、肌酸激酶同工酶（CKMB）、CK 及LDH［14］。其中CK 屬于靈敏度較高的指標(biāo)，它存在于心臟、肌肉及腦等組織的胞漿及線粒體中，在分解和合成ATP 的過程中起到關(guān)鍵作用。CK 在急性心肌梗死診斷過程中具有較好的臨床價(jià)值［15］，可在發(fā)病早期的血液中檢測(cè)出來。LDH 雖然敏感性不如CK，但其在急性心肌梗死的病程觀察中具有重要的價(jià)值，如LDH 在病程中再次升高或恢復(fù)緩慢，可預(yù)示心肌再梗死、梗死范圍擴(kuò)大或恢復(fù)灌注失敗。本研究選用CK、LDH 作為觀察指標(biāo)，一方面可以確保心肌缺血檢測(cè)的靈敏性，另一方面又能客觀反映恢復(fù)灌注的情況。SOD 是生物體內(nèi)一種重要的氧自由基清除劑，具有重要的生物學(xué)功能。心肌缺血再恢復(fù)灌注后，會(huì)產(chǎn)生大量的氧自由基，氧自由基在SOD 的催化作用下轉(zhuǎn)變?yōu)檫^氧化氫，過氧化氫在過氧化氫酶和過氧化物酶的作用下會(huì)分解為無害的水。所以當(dāng)體內(nèi)SOD 缺乏或者SOD 活性下降時(shí)，氧自由基將會(huì)大量累積，并與生物大分子及心肌細(xì)胞膜發(fā)生過氧化反應(yīng)，進(jìn)而引發(fā)氧化應(yīng)激損傷，導(dǎo)致機(jī)體受損，同時(shí)產(chǎn)生大量的MDA，因此，MDA 的含量可以作為判斷心肌細(xì)胞受損程度的指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，三參丹飲能降低心肌缺血再灌注損傷大鼠血清中CK、LDH 水平，其機(jī)制可能是通過上調(diào)SOD 活性，降低MDA 水平，提高氧自由基清除率，進(jìn)而起到保護(hù)心肌的作用。

目前，臨床中用藥仍以組方合劑為主，所以目前研究亦局限于復(fù)方合劑的整體作用效果，具體起效藥物或具體單體藥效成分，仍有待進(jìn)一步探索。