GSDMD介導(dǎo)的細胞焦亡在糖尿病視網(wǎng)膜病變中的研究進展△

黎曉冬 謝學(xué)軍 宿曉娟 武海燕 何潤西

Cookson最早以pyroptosis一詞描述細胞焦亡，來源于希臘的詞根pyro表示火或發(fā)燒有關(guān)的意義，ptosis本意為下降，在此描述程序性細胞死亡的炎癥性質(zhì)，同時表明這是一種與細胞凋亡、壞死不同的細胞死亡方式[1-2]。近年來確定了Caspase-1/4/5/11介導(dǎo)的GSDMD結(jié)構(gòu)域間的裂解決定了細胞的焦亡，即在任何細胞系統(tǒng)中，GSDMD結(jié)構(gòu)域都足以驅(qū)動細胞焦亡，是細胞死亡性質(zhì)的決定性因素[3]。因此，細胞焦亡過程即為炎癥小體激活Caspase-1/4/5/11 后切割GSDMD，形成的GSDMD-N 端裂解后致細胞膜孔隙形成、細胞內(nèi)容物腫脹破裂流出后致細胞炎癥性死亡。細胞焦亡是近十年的研究熱點之一，在各個系統(tǒng)中的研究進展迅速，為多種難治性疾病帶來了新的治療思路，在眼部疾病中也有部分研究報道。本文主要對GSDMD介導(dǎo)的細胞焦亡在糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)中的研究進展進行綜述。

1 細胞焦亡的主要分子機制

細胞焦亡是一種新發(fā)現(xiàn)的細胞程序性死亡的方式，目前研究顯示其主要有兩種不同的激活通路，一種是依賴于激活的Caspase-1切割GSDMD后誘導(dǎo)的高度炎癥性溶解性的細胞死亡，稱為經(jīng)典細胞焦亡通路；在Caspase-1介導(dǎo)的經(jīng)典炎癥小體通路中，不同的病原相關(guān)分子模式或損傷相關(guān)分子模式分別激活相應(yīng)的細胞質(zhì)炎癥小體傳感器，即各類NOD樣受體(NLR)蛋白，包括 NLRP1、NLRP3、NLRC4、AIM2和Pyrin，然后招募Caspase-1和接頭蛋白凋亡相關(guān)微粒蛋白(ASC)形成炎癥小體，隨后觸發(fā)其二聚化和Caspase-1蛋白水解轉(zhuǎn)化為活性亞基p10和p20，激活的Caspase-1隨后切割蛋白GSDMD形成孔洞，細胞內(nèi)容物大量釋放出來，同時分泌較多白細胞介素(IL)-1β 和 IL-18至細胞外，引起嚴重的炎癥反應(yīng)。第二種則是Caspase-4/5/11介導(dǎo)的非經(jīng)典細胞焦亡通路，在非經(jīng)典型細胞焦亡通路中，革蘭陰性菌的胞質(zhì)脂多糖(LPS)直接誘導(dǎo)小鼠Caspase-11或人Caspase-4/5的激活。激活的Caspase-11/4/5也可裂解GSDMD，裂解的GSDMD通過釋放有功能的GSDMD-N端在質(zhì)膜上形成孔洞[4]，同時Caspase-1被NLRP3-ASC結(jié)合體激活來切割還沒有活性的pro-IL-1和pro-IL-18，從孔洞中釋放成熟的IL-1β和IL-18，誘發(fā)細胞焦亡[5-6]。上述研究表明，GSDMD是兩種激活通路的最終執(zhí)行者，也是決定細胞焦亡的關(guān)鍵因素[7]。

2 GSDMD與細胞焦亡的關(guān)系

GSDMD是gasdermin 成孔蛋白家族中目前研究最為廣泛和深入的一類蛋白，GSDMD位于染色體8q24.2。Saeki等[8]發(fā)現(xiàn)，GSDMD在上消化道的上皮細胞中表達。近年的研究發(fā)現(xiàn)，GSDMD在巨噬細胞、單核細胞[9]、中性粒細胞[10]、CDT8細胞[11]中也呈高表達。人GSDMD蛋白大約由480個氨基酸組成，含有能形成膜孔誘導(dǎo)細胞溶解的N端結(jié)構(gòu)域(NTDs)：GSDMD-N端易位到質(zhì)膜上，特異性識別某種酸性脂質(zhì)寡聚化后，形成允許成熟的IL-1β和IL-18通過的內(nèi)徑為10～15 nm的孔[12]，多個孔洞引起細胞內(nèi)外滲透壓改變，細胞膜破裂；而其C端結(jié)構(gòu)域(CTDs)通過分子內(nèi)結(jié)構(gòu)域關(guān)聯(lián)抑制細胞殺傷[13]，通過將NTDs的“羥甲基異丙醇1-羥甲基異丙醇2環(huán)(β1-β2)”與CTDs中一個常見的疏水性囊袋結(jié)合，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)域界面的裂解，從而破壞了CTDs自抑制作用，促進了膜透性和細胞溶解，從而促進了細胞焦亡[14]；gasdermin家族其他成員的NTDs都具有裂解細胞膜形成孔洞的活性,其過度表達都會導(dǎo)致細胞發(fā)生焦亡[15]。

3 關(guān)于GSDMD 的抑制劑

壞死磺酰胺(NSA)是一種小分子化合物，作為GSDMD 的抑制劑，與Caspase-1抑制劑貝納卡桑(VX-765)都能顯著抑制皂苷Polyphyllin VI(PPVI)誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體的激活[16]。實驗證實，NSA在體外和體內(nèi)通過GSDMD上的Cys191直接綁定到GSDMD，抑制p30-GSDMD的毒性及GSDMD-N端的寡聚，導(dǎo)致無法形成孔洞，抑制釋放IL-1β和其他pore-mediated信號分子，這也意味著NSA能特異性地抑制炎癥小體，從而激活下游的炎癥細胞死亡，同時使其他固有信號通路保持完整和功能[17]?；旌献V系激酶樣域(MLKL)是一種致細胞凋亡壞死的具有N-末端4螺旋束(4HB)和假激酶結(jié)構(gòu)域的多結(jié)構(gòu)域蛋白，NSA也能通過結(jié)合MLKL的4HB結(jié)構(gòu)域抑制細胞凋亡[18]。綜合上述研究可見，NSA對研究細胞凋亡及GSDMD 介導(dǎo)的細胞焦亡有著十分重要的意義，尤其是為研究GSDMD 介導(dǎo)各個系統(tǒng)的炎癥性疾病提供了有力的依據(jù)。

4 細胞焦亡在DR中的研究

DR最開始被認為是一種單純的微血管疾病，現(xiàn)在被認為是一種多因素導(dǎo)致視網(wǎng)膜微血管改變的慢性炎癥性疾病[19]。DR的特征是由于毛細血管阻塞、視網(wǎng)膜內(nèi)微血管異常、視網(wǎng)膜新生血管(RNV)及動靜脈吻合支形成等引起的視網(wǎng)膜血流障礙[20]。DR導(dǎo)致視網(wǎng)膜細胞的明顯損傷，如視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的損傷。根據(jù)眼底病變程度的不同，DR可分為非增生型DR(NPDR)和增生型DR(PDR)。早期NPDR的特征是微血管瘤，周細胞減少和滲出物的分泌。PDR發(fā)生在晚期，主要以RNV形成為特征；炎癥和血管生成是DR的兩種主要機制，它們更多地是相互作用的，而不是單獨的過程。然而，它們相互作用的潛在機制仍不清楚。新近研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中，NLRP3過表達可誘導(dǎo)促炎細胞因子和VEGF表達的增加，故NLRP3炎癥小體是DR炎癥和促血管生成的潛在交叉點[21]；臨床試驗發(fā)現(xiàn)，DR患者玻璃體中存在炎癥小體成分，隨著VEGF水平的增加，Caspase-1和IL-18水平均明顯升高，尤以PDR患者為甚[22]。Yin等[23]采用免疫組織化學(xué)方法觀察到NLRP3、ASC和Caspase-1定位于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層和內(nèi)核層。同時，他們發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中NLRP3、ASC、Caspase-1及其下游成熟分子IL-1β、IL-18的表達增加。在一項研究NLRP3炎癥小體抑制劑MCC950的報道中，DR患者手術(shù)切除的增生膜中NLRP3、Caspase-1和IL-1β均有高表達[24]；這些發(fā)現(xiàn)證實炎癥小體的激活誘發(fā)的炎癥反應(yīng)在DR中起重要作用。ATP激活的P2X7受體促進NLRP3炎癥小體及其下游IL-1β的過表達，損傷高血糖狀態(tài)下的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞，從而增加血管通透性[25]，因此，P2X7R有望成為抑制DR進展的一個新靶點。另外，活性氧(ROS)累積過多產(chǎn)生嚴重的氧化應(yīng)激被證實是導(dǎo)致并加重DR的一個重要原因[26]，高水平的ROS與VEGF的表達上調(diào)有關(guān)，而VEGF是視網(wǎng)膜血管滲漏和RNV形成的主要調(diào)節(jié)因子[27]。嚴重的氧化應(yīng)激可以誘導(dǎo)細胞焦亡的發(fā)生，Zhou等[28]研究證實，硫氧還蛋白相互作用蛋白在ROS釋放條件下與NALP3結(jié)合并激活NALP3炎癥小體后導(dǎo)致了細胞的炎癥性死亡；最新研究證實，蛋白精氨酸甲基化轉(zhuǎn)移酶5 (PRMT5)參與缺血和缺氧誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和細胞焦亡，PRMT5被抑制后激活Nrf2/HO-1信號通路減弱ROS介導(dǎo)的細胞焦亡[29]。ROS介導(dǎo)的NLRP3炎癥小體激活損傷RPE細胞，維生素D3[30]和非諾貝特[31]被證實能針對ROS以抑制DR發(fā)病過程中RPE的損傷，同時非諾貝特也能保護DR患者的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞免受脂質(zhì)過氧化損傷[32]；有意義的是，研究表明，降低血漿中同型半胱氨酸水平能抑制高水平ROS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激[33]，從而阻斷視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞焦亡[34]。適當(dāng)?shù)腞OS產(chǎn)生的輕度氧化應(yīng)激能促進細胞的修復(fù)，因此，如何控制視網(wǎng)膜內(nèi)ROS氧化應(yīng)激水平成為抑制DR進展的重要研究方向。此外，有研究證實，黃芩苷通過上調(diào)miR-223基因的表達可達到延緩RPE細胞焦亡的目的[35]。視網(wǎng)膜微血管周細胞(HRPC)的功能改變及缺乏是DR最早的病理改變之一。Yu等[36]在研究長鏈非編碼RNA心肌梗死相關(guān)轉(zhuǎn)錄本抑制原發(fā)性人HRPC焦亡機制時，使用晚期糖基化終末產(chǎn)物修飾的牛血清白蛋白(AGE-BSA)來模擬DR環(huán)境，結(jié)果表明，AGE-BSA可誘導(dǎo)Caspase-1、GSDMD蛋白的活性裂解及IL-1β、IL-18和乳酸脫氫酶的釋放，細胞活性降低，提示HRPC中出現(xiàn)GSDMD介導(dǎo)的細胞焦亡現(xiàn)象。

綜上可知，進一步探索NLRP3炎癥小體/GSDMD蛋白介導(dǎo)的細胞焦亡機制對研究DR的發(fā)病機制和開拓新的臨床診療思路非常重要。

5 展望

細胞焦亡是一種新發(fā)現(xiàn)的程序性的細胞死亡方式，對于多種免疫相關(guān)的疾病是一把雙刃劍。一方面，它有助于保護多細胞生物免受細菌、病毒、真菌等感染；另一方面，過度激活的細胞焦亡可能導(dǎo)致慢性炎癥[5]。隨著人們對細胞焦亡的分子機制、生理生化研究的深入，許多心血管、腫瘤等疾病有了新的治療手段。在眼科領(lǐng)域，細胞焦亡也為眼科學(xué)者提供了新的研究和突破思路，但目前細胞焦亡在眼科領(lǐng)域研究較少，尤其是在DR方面的探索研究尚處于起步階段，仍有許多問題亟待解決，但其前景值得期待。